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    Key Words
    PAT
    Soft-Sensor
    Sauerstofftransferrate
    Bioreaktorcharakterisierung
    Pharmazeutische Produktion

    Neue kLa-Wert-Messung für den optimalen Bioprozess
    Biotechnologie
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    Droid  Signika

    Einleitung Grundlagen zur kLa-Wert-Bestimmung Optimierte Messmethode garantiert präzisere Werte Anwendungstests: kLa-Wert in bakteriellen Fermentationen (...) Potenzial der Methode: kLa-Wert in tierischen Zellkulturbioreaktoren – Optimierung der (...) Benefits im Überblick
    Abbildung 1: kLa-Mess-Vorrichtung (Quelle aller Abbildungen: ZETA Biopharma).
    Dr. Thomas Maischberger und Florian Krainer · ZETA Biopharma, Lieboch/Graz (Österreich)

    Korrespondenz:

    Dr. Thomas Maischberger, ZETA Biopharma, Zetaplatz 1,
    8501 Lieboch/Graz (Österreich); e-mail: Thomas.Maischberger@zeta.com

    Dr. Thomas Maischberger
    Dr. Thomas Maischberger ist Prozessingenieur bei ZETA Biopharma und hat Erfahrung in den Fachgebieten der industriellen Mikrobiologie, Enzymtechnologie und Bioprozessoptimierung. Er hat einen Masterabschluss in Lebensmittel- und Biotechnologie und promovierte an der Universität für Bodenkultur in Wien. Seit 2012 ist Maischberger im Bereich Industrieanlagenplanung und -bau in der Lebensmittel- und Pharmaindustrie tätig.
    Florian Krainer
    Florian Krainer hat Verfahrenstechnik mit Schwerpunkt Anlagen- und Prozesstechnik an der TU Graz studiert. Während seiner Masterarbeit hat er sich intensiv mit der Entwicklung der neuen kLa-Messmethode beschäftigt. Seit 2012 arbeitet er bei der Firma ZETA Biopharma als Projektentwickler und ist für die Auslegung von Fermentern, Bioreaktoren und deren Rührwerke zuständig.

    Zusammenfassung

    Die Ansprüche für Bioreaktoren in der Pharmabranche sind in den letzten Jahren stark gestiegen, um funktionsfähige Präparate mit höchster Effizienz herzustellen. Lange Zeit glichen Bioprozesse einer Blackbox: Unzählige Faktoren nehmen Einfluss auf das Zellwachstum, konnten aber bislang oftmals nicht zuverlässig gemessen oder ausgewertet werden. Einer der wichtigsten Performanceparameter ist der volumetrische Massetransferkoeffizient (kLa). Ein neuentwickeltes System zur Bestimmung des kLa-Werts revolutioniert das Bioreaktordesign im Anlagenbau: Messungen für die kLa-Wert-Bestimmung sind nun an jedem beliebigen Punkt im Bioreaktor möglich und liefern somit erstmals ein umfassendes Bild von den Produktionsbedingungen. Besonderer Bonus für die Anlagenbetreiber: Das System findet nicht nur Anwendung im Design neuer Bioreaktoren, sondern kann – ganz ohne strukturelle Änderungen – auch auf bestehende Anlagen angewendet werden, um tiefe Einblicke in bestehende Bioprozesse zu erlangen.

    Einleitung

    Bioreaktordesign ist ein komplexes Thema im Anlagenbau. Die biotechnologische Herstellung von pharmazeutischen Produkten erfolgt überwiegend mithilfe von Mikroorganismen und tierischen Zellkulturen. Damit eine maximale Produktausbeute in diesem System erreicht wird, muss zum einen die Optimierung des Arbeitstiers „Zelle“ auf molekulargenetischer Ebene erfolgen, und zum anderen müssen eben diese Zellen im Bioreaktor optimale Wachstumsbedingungen vorfinden. Eine der wichtigsten Voraussetzung dabei ist eine ausreichende Nährstoff- und v a. Sauerstoffversorgung, damit die Zellatmung optimal ablaufen kann. Weitere wichtige Parameter für die Zellvitalität sind ein effizienter Abtransport von Metaboliten und toxischen Abfallprodukten sowie optimale pH-, Ionen- und Temperaturbedingungen.

    Neben der Erhaltung der Zellvitalität müssen produktionsspezifische Anforderungen wie die Reproduzierbarkeit des Prozesses und die dadurch gleichbleibende Qualität von Charge zu Charge gewährleistet werden. Oft bedarf es für die einzelnen pharmazeutischen Produkte individueller Lösungen, um zufriedenstellende Ausbeuten zu erreichen. Die genaue Kenntnis von Auswirkungen der Einflussparameter auf das Wachstum der Zellen ist wesentlich für das Prozess- und Anlagendesign, insbesondere in Hinsicht auf die Skalierbarkeit vom Labor- in den Produktionsmaßstab (und retour). Je früher erfahrene Anlagenbauer und Prozessingenieure in den Planungsprozess für neue Produkte eingebunden werden, desto eher lassen sich Planungsfehler vermeiden und die Skalierung verläuft unproblematisch.

    Ein hoher volumetrischer Massetransferkoeffizient (kLa-Wert) ist ein essenzieller Parameter für die Produktionsleistung in einem Bioreaktor: Er beschreibt die Effizienz des Gastransfers (z. B. Sauerstoff) von der Gasphase in die Flüssigkeit unter bestimmten Prozessbedingungen, denn nur Gelöstsauerstoff ist für die Zelle verwertbar. Durch optimale Nährstoffbedingungen für die Zellen kann auch der geforderte Biomasseanteil erreicht werden und damit Anlagenbetreiber schnell und sicher zu einer hohen Produktausbeute führen.

    Der kLa-Wert wird von einer Reihe Faktoren beeinflusst; zudem lassen sich vom kLa-Wert auch Rückschlüsse auf die Optimierung von Prozessparametern (z. B. Rührleistung, die optimale geometrische Bauform, die Begasungsrate und Kultivierungsstrategien oder die Dimensionierung des Scale-Down-Modells) für eine zufriedenstellende Produktqualität im Up-Scale ziehen. Diese Tatsache macht die kLa-Wert-Bestimmung zu einem attraktiven Planungstool im Bioreaktordesign: Unbekannte Faktoren, deren Einflüsse auf das Wachstum und die Produktbildung oft gar nicht quantifizierbar sind, lassen sich mit dem kLa-Wert genau bestimmen. Ziel ist es, ein mechanistisches Verständnis über den Bioprozess zu erlangen und diesen damit auch zu kontrollieren. Die zeitnahe Berechnung des kLa-Werts als kritischen Prozessparameter zu unterschiedlichen Prozessphasen ergibt ein zuverlässiges Process-Analytical-Technology(PAT)-Tool, das ein wichtiger Schritt in Richtung eines „gläsernen“ Bioprozesses ist.

    Grundlagen zur kLa-Wert-Bestimmung

    Die Sauerstofftransferrate (Oxygen Transfer Rate, OTR) und damit auch der kLa-Wert werden von einer Vielzahl von Variablen beeinflusst, die mit dem Bioreaktordesign in Zusammenhang stehen. Die hydrodynamischen Bedingungen des Bioprozesses, die Einflüsse auf die OTR haben, sind wiederum abhängig von

    • den Betriebsparametern (volumenbezogene Rührerleistung (P/V), Gasbelastung des Behälterquerschnitts – die sog. Leerrohrgeschwindigkeit, Temperatur, pH-Wert),

    • den physiochemischen Eigenschaften der Kultur (Medienkomponenten, Salzgehalt, Viskosität, Dichte, Oberflächenspannung, Diffusionskoeffizient sowie Koaleszenzparameter),

    • den geometrischen Parametern des Bioreaktors (Rührer, Behälter, Sparger) und

    • der Anwesenheit von sauerstoffverbrauchenden Zellen [1].

    Sobald sich nur einer dieser vielen Faktoren ändert, beeinflusst dies auch den kLa-Wert. Antischaummittel z. B. verringern den kLa-Wert um bis zu einen Faktor 2, Salze hingegen führen zu einer Erhöhung um bis das Vierfache. Dadurch gestalten sich Voraussage und Modellierung des kLa-Werts als äußerst schwierig. Grundsätzlich gilt für schnellwachsende Bakterien- und Hefezellen: je höher der kLa-Wert, desto besser ist das für die Produktion.

    Für Prozessingenieure ist die Wahl der passenden Engineering-Parameter essenziell, damit die biologischen Erfordernisse der Zelle optimal erfüllt werden. Wichtige Leistungsindikatoren, die vorab berechnet werden, sind: die Rührleistung, der durchschnittliche spezifische Energieeintrag, Mikro- und Makroturbulenzen und die einwirkende Scherkraft. Zahlreiche mathematische Modelle, die die Kinetik im System abbilden, stehen zur Verfügung und sind bei der Charakterisierung von Bioreaktoren nicht wegzudenken. Sie bilden somit die Basis, um auch den kLa-Wert realistisch vorherzusagen. Diese empirisch ermittelten Formeln setzen jedoch voraus, dass man einen ähnlichen Bioreaktor bereits exakt charakterisiert hat.

    Für die Bestimmung des tatsächlichen kLa-Werts im laufenden Bioreaktor werden Sauerstoffsensoren verwendet. Bislang ereignete sich die Messung allerdings an nur einem Punkt im Bioreaktor, dem Sondenkranz am unteren Teil des Bioreaktors. In der Praxis kann die Verteilung des Gelöstsauerstoffs im Reaktor jedoch stark variieren und oft wird das Messergebnis durch die große Anzahl an Gasblasen verfälscht. Beides führt zu unzureichenden Messergebnissen, die die Charakterisierung ungenau machen.

    Optimierte Messmethode garantiert präzisere Werte

    Der Standard-Sauerstoffsensor ist mit einer Membran ausgestattet, die vor allem auf Robustheit ausgelegt ist. Der Sensor muss zwischen den einzelnen Fermentationen vielen Zyklen von Cleaning in Place (CIP) und Sterilisation in Place (SIP) standhalten, bevor die Membran gemäß Serviceintervall getauscht werden muss. Dadurch haben diese Membranen eine Schichtdicke, die v. a. der Prozesssicherheit geschuldet ist. Dies hat jedoch zur Folge, dass die Diffusion der Sauerstoffmoleküle verlangsamt abläuft und zu längeren Ansprechzeiten der Sonde führt. Ein geeigneter optischer Sauerstoffsensor für die kLa-Wert-Ermittlung sollte jedoch eine möglichst kurze Ansprechzeit aufweisen, um entsprechende Messgenauigkeiten auch bei hohen kLa-Werten zu erzielen. Idealerweise sorgen ein Messintervall von < 1 Sekunde, eine automatische Temperaturkompensation des Messwertes und eine einfache Zwei-Punkt-Kalibrierung des Sensors für reproduzierbare Messergebnisse.

    Bei dieser neuentwickelten Methode kann die kLa-Messtechnik in zweierlei Arten im Bioreaktor verbaut sein: zum einen mit einer Sauerstoff Einbauelektrode, die direkt in den Bioreaktor ragt (in situ). Hier ist man sehr stark vom Rührkesseldesign abhängig, da die Anzahl und Anordnung der Stutzen zur bestmöglichen Positionierung der Instrumente bzw. Einlaufrohre geplant wurde. Dadurch grenzen die designtechnischen Gegebenheiten sehr die Möglichkeiten ein, unterschiedliche kLa-Messpunkte zu definieren. Die meisten Stutzen, die zur submersen Messung des Gelöstsauerstoffs eine Sauerstoffelektrode aufnehmen können, sitzen am Sondenkranz, also im unteren Viertel des Behältervolumens. Weitere Stutzen entlang der Mantelhöhe werden meist nicht vorgesehen, da diese aus prozesstechnischer Sicht nur Nachteile mit sich bringen, etwa die Verringerung der Heiz- und Kühlfläche.

    Die neuentwickelte Messvorrichtung, bei der der Sauerstoffsensor als Durchflussmesszelle angeströmt wird, ragt über jeden beliebigen Behälterstutzen mit der Entnahmeleitung in den Bioreaktor (inline; Abb. 1). Diese Entnahmeleitung kann je nach Behältergeometrie und Rührerdesign angepasst werden. Die Entnahmeleitung kann nun so gefertigt werden, dass Messpunkte z. B. unter dem untersten Rührorgan von einem Stutzen im Sondenkranz des Reaktors erreicht werden können. Auch Zonen im oberen Teil des Fermenters können beprobt werden, indem das Entnahmerohr über einen Reservestutzen im Behälterdeckel bis zur gewünschten Position geführt wird. Durch die Loslösung dieser örtlichen Gebundenheit ist eine wesentlich detailliertere Bestimmung des kLa-Werts zu erzielen. An der Entnahmeleitung sitzt ein Filter, welcher störende Gasblasen eliminiert. Eine peristaltische Pumpe leitet den Probenstrom (Pfropfenströmung) in eine Messkammer zum optischen Hochgeschwindigkeitssensor. Der Sensor reagiert innerhalb weniger Zehntelsekunden und misst den aktuellen Gelöstsauerstoffgehalt. Die Messvorrichtung lässt sich in jeden Behälter mit Prozessanschluss und einem Rührwerk integrieren. Besonders vorteilhaft ist die Verschieb- und Verdrehbarkeit der Entnahmeleitung, wodurch ein Sauerstoffgehaltprofil über verschiedene Höhenschichten erstellt werden kann. Dadurch werden unterschiedliche Zonen und physikalische Bedingungen ganzheitlich abbildbar. Der Probenstrom wird über einen weiteren Stutzen in den Behälter rückgeführt, um das Arbeitsvolumen v. a. bei kleineren Reaktoren konstant zu halten. Dabei ist zu beachten, dass dieser möglichst weit entfernt von der Entnahmeleitung positioniert ist, um hier eine gegenseitige Beeinflussung auszuschließen.

    Zur kLa-Wert-Bestimmung existieren 2 Methoden, die bei großen Industrieanlagen Anwendung finden: Bei der Dynamic-Startup-Methode (DSM, Abb. 2) wird das Medium im Bioreaktor im ersten Schritt mit Stickstoff „entgast“, d. h., der Gelöstsauerstoff wird mithilfe von Stickstoff ausgetrieben, welcher durch den Sparger das Medium sättigt [2]. Der Gelöstsauerstoffgehalt im Medium beträgt somit bei der ersten Messung 0 %. Im nächsten Schritt wird das Medium erneut durch analoges Starten des Rührers und Begasen mit Gelöstsauerstoff angereichert. Danach erfolgt eine neuerliche Messung und der kLa-Wert kann präzise aus den zeitlichen Konzentrationsunterschieden bestimmt werden. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass industrielle Bioreaktoren mit steriler Prozessluft und Stickstoffanschluss ausgestattet und somit die technischen Voraussetzungen für die Methode gegeben sind. Besondere Aufmerksamkeit muss einer optimierten Prozessführung gezollt werden, damit die Anfahrts- und Totzeiten des Systems möglichst geringgehalten werden.

    Bei der Dynamic-Pressure-Methode (DPM) wird bei konstanter Begasung und konstanter Drehzahl ein Gleichgewichtszustand im Reaktor eingestellt. Danach wird der Druck im Behälter sprunghaft erhöht. Durch diese Druckerhöhung stellt sich nach einer gewissen Zeit ein höherer Gelöstsauerstoffgehalt im Medium ein [3]. Auch hier wird aus den zeitlichen Konzentrationsunterschieden der kLa-Wert berechnet. Bei dieser Methode beeinflussen Anfahr- und Reaktionszeit des Systems (Rührer, Ventilschaltungen) keinesfalls die Messergebnisse. Allerdings hat sich in der Praxis bei Großanlagen das genaue, aber dennoch schnelle Einstellen des Behälterdruckes als äußerst schwierig erwiesen, denn die Regelung bei hochbegasten industriellen Systemen im Differenzdruckbereich von ca. 0,2 bar funktioniert nur träge – dadurch werden die kLa-Messergebnisse verfälscht.

    Im Rahmen der hier vorgestellten Studie kam die DSM zum Einsatz. Die Entwicklung der Versuchsmethodik, die im internen Technikum optimiert und bereits in großindustriellen Anlagen erfolgreich angewendet wird, beinhaltet die Auswahl der richtigen Messinstrumente, Messmethoden und experimentellen Techniken. Mit diesem notwendigen Rüstzeug wurde der kLa-Wert durch systematische Änderung einzelner Prozessparameter experimentell bestimmt. Für die Berechnung wurden anschließend die Ergebnisse des zugrundeliegenden Berechnungsmodells an die experimentell ermittelten Gelöstsauerstoffkurven iterativ angepasst (Abb. 3). Dabei wurden auch die Sensoransprechzeit und die Totzeit des Systems berücksichtigt (Abb. 4).

    Dieses spezielle Ergebnis ist eine globale und sehr grobe Repräsentation des Systems und sagt noch nichts über die Zonenverhältnisse im Fermenter aus. Werden nun an mehreren Stellen im Bioreaktor diese Messungen durchgeführt, kann für jeden Messpunkt eine Korrelation erstellt werden (Abb. 5). Umso engmaschiger diese Messpunkte definiert sind, desto feingliedriger entsteht daraus die Charakterisierung der Zonen. Aus Abb. 6 wird ersichtlich, dass sich im Vergleich zweier kLa-Messpunkte bei unterschiedlichen Leistungseinträgen und Begasungsraten Zonen bilden. Diese sind im vorliegenden Beispiel besonders bei niedriger Rührerdrehzahl und in weiterer Folge auch noch bei 63 % der maximalen Rührleistung in Kombination mit sehr hohen Begasungsraten stark ausgebildet. Erst bei Maximaldrehzahl kann der maximale Luftstrom homogen im Fermenter verteilt werden. Die sich überlagernden Messpunkte beschreiben den minimal nötigen Leistungseintrag/Rührerdrehzahl, um die Luftmenge komplett zu dispergieren, und sind daher als optimaler Betriebspunkt anzusehen. Erst dann betreibt man den Reaktor innerhalb der Strömungsregimegrenzen „Rezirkulation“. Stellt man die kLa-Messwerte einer Zone in Relation zu Leistungseintrag und Gasleerrohrgeschwindigkeit dar (Abb. 7), erkennt man, dass die Rührerdrehzahl einen größeren Einfluss auf den kLa-Wert hat als die Begasungsrate. Erst bei höheren Drehzahlen nimmt die Gewichtung der Begasungsrate zu.

    Die Ausprägung und Verteilung der Zonen in einem Fermenter sind sehr spezifisch – abhängig von den geometrischen Dimensionen und gewählten Prozessparametern. Es ist nicht möglich, diese quantitativ zu charakterisieren, ohne deren horizontale wie auch vertikale Verteilung messen zu können. In dem o. g. Beispiel sind 2 von 6 Messpunkten exemplarisch dargestellt (Abb. 6). Nur durch die beschriebene Messmethode kann die räumliche Ausdehnung dieser Zonen bestimmt werden, da durch diese beliebig viele Positionen im Rührreaktor beprobt werden können. Erst dadurch ist eine korrekte Mittelung des kLa-Werts für das Gesamtsystem möglich.

    In Zukunft sollen die empirischen Modelle weiter verfeinert werden, um auch diese speziellen Wechselwirkungen zwischen den Rührorganzonen besser in Verbindung bringen zu können (Abb. 8). Dadurch lassen sich Strömungsregime in den einzelnen Sektionen besser vorhersagen.

    Anwendungstests: kLa-Wert in bakteriellen Fermentationen (20 L–15 000 L) zur Bestimmung der Zonenbildung

    Das Wissen um die zentrale Stellung des kLa-Werts bei der Fermentation von Einzellern ist nicht neu. Gelöstsauerstoff ist allzu oft das limitierende Substrat in mikrobiologischen Fermentationen. Für Bakterien und Hefen liegt die kritische Luftsättigung bei 10–50 %. Nur über diesem kritischen Wert ist die Sauerstoffversorgung nicht wachstumsinhibierend. Daher ist es für ein optimales Zellwachstum und maximale Produktbildung essenziell, den Gelöstsauerstoffgehalt über diesem kritischen Wert zu halten. Dies wird erreicht, indem der Bioreaktor durch einen Sparger mit Luft oder reinem Sauerstoff gezielt begast wird. Bei einem hocheffektiven Bioprozess sollte daher die Sauerstoffmassentransferrate von der Gasblase in das Medium (Oxygen Transfer Rate, OTR) gleich oder größer der Rate sein, mit welcher die wachsenden Zellen den Sauerstoff aufnehmen (Oxygen Uptake Rate, OUR).

    In Bioreaktoren mit großem Volumen besteht v. a. das Problem der Inhomogenität des Behälterinhalts – es bilden sich Zonen aus. Mikroorganismen reagieren sehr sensibel auf geringe Schwankungen sowohl von Temperatur als auch von Nährstoff-, Sauerstoff- und Metabolitkonzentrationen. Diese Inhomogenitäten, Konzentrations-, Temperatur- und Sauerstoffgehaltgradienten in großen Bioreaktoren entstehen u. a. durch das mangelnde Design der Begasungseinheiten, die Rührorgane des Rührwerks, die Geometrie der Substratzugabe und die Wahl der Prozessparameter. Durch das Zusammenspiel der einzelnen Gegebenheiten entstehen in dem Bioreaktor Zonen mit Nährstoffüberangebot und Gebiete mit stark reduziertem Sauerstoffgehalt – meist im oberen Bereich und in Bodennähe. Insbesondere die anaeroben (sauerstofffreien) Zonen senken nicht nur die Produktivität, sondern fördern auch eine irreversible Produktion unerwünschter Nebenprodukte. Glykosilierungsfehler sowie Fehlfaltungen bei der rekombinanten Proteinsynthese sind die Folge. Diese Zonen sind in großen Bioreaktoren mit einem Arbeitsvolumen < 10 m3 kaum zu vermeiden. Durch die neue kLa-Messmethode ist es möglich, Verteilung und Ausdehnung dieser Zonen quantitativ zu erfassen und daraufhin prozessrelevante Anpassungen zu entwickeln.

    Durch die genaue Charakterisierung des Bioreaktors lässt sich die Prozessführung bzgl. Rührerdrehzahl und Begasungsrate gut anpassen (Kaskadenregelung). Denn je nach Zelldichte und Wachstumsphase wird die OTR feinjustiert, um zu jedem Zeitpunkt optimales Wachstum sowie Produktbildung zu garantieren. Darüber hinaus sind auch die Adaptierung der Feed-Strategie oder die Bestimmung von Induktions- oder Erntezeitpunkt ab sofort viel genauer wählbar.

    Die umfangreiche Bioreaktor-Charakterisierung ermöglicht in bestehenden Anlagen auch gezielte mechanische Umbaumaßnahmen. So kann z. B. die Position der Behältereinbauten entsprechend der Zonenverteilung optimal gewählt werden. Das ist v. a. bei schnell wachsenden Bakterienkulturen wie E.coli von großer Bedeutung, wenn die richtige Position der Feed-Zulaufrohre ausgewählt werden soll. Nicht nur die Zugaberate der Kohlenstoffquelle (z. B. Glukose, Glycerol etc.) während der Fed-Batch-Phase, sondern auch die Position im Behälter hat großen Einfluss auf die Produktausbeute und -qualität. Bei Substratüberschuss kommt es zu einer wachstumsinhibierenden Wirkung – ist das Einlaufrohr an einer sauerstoffunterversorgten Stelle positioniert, kann das einen doppelt negativen Einfluss auf das Gesamtsystem haben: Zum einen ist durch die niedrige OTR in dieser Zone das Wachstum sauerstofflimitiert. Zum anderen wird in diese Zone konzentrierte Feed-Lösung zugegeben, welche durch die niedrige Wachstumsrate nur langsam verstoffwechselt wird und zusätzlich – durch den lokalen Konzentrationsunterschied – eine wachstumsinhibierende Wirkung zeigt.

    Der Scale-up bzw. Scale-down von Fermentationssystemen stellt eine große Herausforderung für Ingenieure wie auch Biologen dar. Fundiertes Wissen über das jeweilige biologische System und umfassendes verfahrenstechnisches Verständnis mit Schwerpunkt der Hydrodynamik sind Voraussetzungen, um die Forschungsergebnisse in der Praxis anzuwenden. Hier gilt es aus einer Unzahl von Eigenschaften, Variablen und Kennzahlen die „richtige“ Scale-up-Strategie zu entwickeln. Parameter wie Mischzeit und Massentransferkoeffizienten können aus physikalischen Gründen beim Scale-up nicht linear gehalten werden – es müssen Kompromisse eingegangen werden, die vertretbar sind.

    Der kLa-Wert eignet sich sehr gut als Skalierungsindikator, da über stöchiometrische Beziehungen die OUR berechenbar und die OTR abschätzbar sind. Daraus sind weitere Größen wie Verbrennungsenergie und Wärmeentwicklung berechenbar und stellen die Basis für das Bioreaktor- und Rührerdesign dar.

    Viele Stammverbesserungen und Feed- sowie Prozessoptimierungen werden heutzutage in technischen Scale-down-Modellen durchgeführt, die die Produktionsbedingungen der kommerziellen Anlage nachbilden sollen. Die Betriebs- und Performanceparameter der Großanlage müssen dazu bestmöglich charakterisiert sein: Im Vordergrund stehen hier der Massentransferkoeffizient kLa und die Mischzeit. Die klare Definition des Design Space (Abb. 9), innerhalb dessen Grenzen die Optimierungsversuche im Labor- sowie Pilotmaßstab durchgeführt werden, ermöglicht einen nahtlosen Prozesstransfer vom Testequipment in den kommerziellen Maßstab. Diese Optimierungen müssen für jedes spezifische Produktionssystem durchgeführt werden. Gibt es Stammverbesserungen, Änderungen am Expressionssystem, Adaptierungen an der Medienzusammensetzung oder Optimierungen an der Feed-Strategie, muss der Leistungsparameter kLa-Wert neu bestimmt werden, um die im Scale-down-Modell erreichten Leistungssteigerungen ohne Verluste in den kommerziellen Großmaßstab zu heben.

    Potenzial der Methode: kLa-Wert in tierischen Zellkulturbioreaktoren – Optimierung der Glukose-Feed-Strategie

    Die Kultivierung tierischer Zellkulturen im Rührkesselreaktor hat sich in den letzten 20 Jahren drastisch verändert: Durch erfolgreiche Optimierungen der Zelllinien, Verbesserungen der Kultivierungsmedien, Weiterentwicklungen am Bioreaktordesign und größeres Prozessverständnis werden Zelldichten von 1x108 Zellen/mL mit Produkttitern jenseits der 8 g/L erreicht [4]. Der Fed-Batch-Betrieb hat sich als Standardverfahren für die meisten biopharmazeutischen Produkte herauskristallisiert. Die primäre Kohlenstoffquelle ist Glukose, die nach sporadischer Offline-Glukose-Messung entsprechend zugegeben wird.

    Ein großer Nachteil dieser Methode ist ein ständiges Auf und Ab der Glukosekonzentration im Bioreaktor, was sich nachteilig auf die Produktivität der Zellen und Produktqualität auswirkt [5]. Eine zu niedrige Glukosekonzentration bedeutet eingeschränktes Wachstum, im Gegensatz dazu kann eine hohe Glukosekonzentration im Medium die Produktion toxischer Stoffwechselprodukte wie Ammonium oder Lactat fördern. Auch die Produktqualität wird beeinflusst, da z. B. die Zuckerbeschaffenheit der Wirkstoffe (Glycosylierungsmuster) je nach Glukosegehalt variieren kann.

    Man hält die Glukosekonzentration näher am optimalen Sollwert, wenn in zeitlich kurzen Abständen Proben genommen werden. Dagegen spricht allerdings der Zeitaufwand und das erhöhte Kontaminationsrisiko bei der manuellen Probenahme. Eine nichtinvasive Online-Glukose-Messung wäre hier also zielführend. Die am Markt erhältlichen in-situ-Softsensoren wie RAMAN und NIR sind jedoch für einen weitreichenden Einsatz nur bedingt geeignet. Diese spektroskopischen PAT-Sensoren sind teuer und stellen nach wie vor eine große Herausforderung bei der Auswertung und Interpretation der erhaltenen Daten dar.

    Eine andere Methodik, die Glukosezugaberaten zu optimieren, besteht in der Anwendung einer Advanced-Process-Control(APC)-Strategie, die den Glukose-Feed über die Korrelation der Glukoseaufnahmerate mit der Sauerstofftransferate (OTR) steuert [6].

    APC-Lösungen in Zusammenspiel mit unterschiedlichen Modell- und Kontrollalgorithmen stehen seit einigen Jahren im Forschungsmittelpunkt der biotechnologischen Verfahrensführung. Für die Integration dieser modellbasierten Kontrollstrategien in das Good-Manufacturing-Practice(GMP)-Umfeld großindustrieller Fermentationsanlagen muss das Automatisierungssystem um entsprechende Komponenten erweitert werden. Als erstes müssen relevante Online- und Offline-Prozesswerte in eine gemeinsam auswertbare Datenbasis gebracht werden, die die Grundlage für ein Online-Modell bilden. Die Ergebnisse dieser Modellierung dienen als korrektive Regelgröße für die Feed-Strategie und gewährleisten, dass der Prozess in einem durch die Qualitätskriterien definierten Korridor abläuft. Als entsprechende Kombination aus Software-Tools in einer GMP-Anwendung können hier z. B. das Prozessleitsystem Simatic-PCS7 und die PAT-Anwendung SIPAT der Fa. Siemens miteinander agieren. Dabei wird in SIPAT das notwendige Datenalignment der Prozesswerte durchgeführt. Durch die Modellierung von Soft-Sensoren können aussagekräftige Kennwerte erstellt werden, die als Qualitätsattribute für den entsprechenden Prozess gelten. SIPAT dient hier als Plattform, um den realen Prozess mit den Modellen zu verknüpfen. Über die erstellten Algorithmen können die erforderlichen Steuergrößen wieder über das Automatisierungssystem rückgeführt werden und so auf den laufenden Prozess einwirken.

    Um eine derartige Regelkette in einem GMP-Umfeld realisieren zu können, ist die Datenintegrität als oberstes Gebot unerlässlich. Ein valider Datenfluss ist die Grundlage, um eine APC-Strategie im regulierten Umfeld der Arzneimittelherstellung zur Anwendung zu bringen. Datenintegrität bedeutet u. a. Datentransparenz innerhalb des gesamten Systems bzgl. des Zeitpunkts des Entstehens, der Unterscheidung zwischen Roh- und bearbeiteten Daten sowie der Richtigkeit und Echtheit der Datensätze. Je weniger Medienbrüche in einem solchen System vorhanden sind, desto einfacher ist die Sicherstellung der Datenintegrität und die Validierung aus GMP-Sicht.

    So lassen sich – mit entsprechendem Prozessverständnis – die Kontrollstrategien durch mathematische Modelle in einem Bioprozess verfeinern, und damit Produktsicherheit, -qualität und -ausbeute steigern. Durch dieses Modell ist eine Online-Vorhersage der Glukosekonzentration über die gesamte Kultivierungsdauer hinweg gegeben, und die Glukosemenge im Medium kann viel akkurater nahe des Sollwerts gehalten werden.

    Diese Online-Glukose-APC-Strategie ermöglicht eine Echtzeitvisualisierung und Kontrolle der Glukosekonzentration und ist ein weiterer Schritt in Richtung Prozess- und Produktverständnis. Voraussetzung zur genauen Berechnung der aktuellen OTR ist die exakte Bestimmung des kLa-Werts vorab – was mit der hier vorgestellten Methode gegeben ist. In dieser Methodik stellt der Online-Glukose-APC-Algorithmus die Glukosezugaberate (Kontrolle der Zugabepumpe) entsprechend des vorausgesagten Verbrauchs ein, abgeleitet von der kumulativ berechneten Online-OTR (Abb. 10). Mit diesem isotropen Turbulenzmodell kann auch die Sauerstofftransferrate zu jedem beliebigen Zeitpunkt neu berechnet und dadurch direkt auf den zu erwartenden Glukoseverbrauch geschlossen werden. Ist dieser errechnete Wert kleiner als der Sollwert, wird die Zugabepumpe automatisch für ein Zeitintervall eingeschaltet.

    Durch diesen stark linearen Zusammenhang zwischen kumulativer OTR und Glukosekonzentration kann diese einfach zu berechnende Messgröße als Soft-Sensor für die Online-Vorhersage der Glukosekonzentration im Medium herangezogen werden. Ohne zusätzliche Sensoren, Abgasanalysen und Änderungen in den Standard Operating Procedures (SOPs) kann diese relativ einfache Kontrollstrategie implementiert werden.

    Benefits im Überblick

    Die oben angeführten Beispiele verdeutlichen den enormen Nutzen einer akkuraten kLa-Wert-Bestimmung. Die beschriebene Messmethode, welche kürzlich zum Patent angemeldet wurde [7], erleichtert die Charakterisierung neuer Bioreaktoren, wenn es darum geht, neue Bauteile (wie Rührer oder Sparger) zu testen oder neue Betriebsbedingungen zu evaluieren. Der neu designte Bioreaktor und die gewählten Betriebsbedingungen sollten das biologische System zu jedem Zeitpunkt in Wachstum und Produktivität unterstützen und keinen limitierenden Faktor darstellen.

    Die neue Methode ermöglicht erstmals eine zuverlässige Prozessoptimierung und die Erarbeitung von Skalierungsmodellen. Die mechanischen und prozesstechnischen Limitierungen vorhandener Produktionsanlagen und der damit einhergehende Leistungsverlust können von nun an über gezielt gewählte Prozessbedingungen im Labor- und Pilotmaßstab frühzeitlich in Betracht gezogen werden. Rührleistung und Begasungsvolumen sind dabei wichtige Parameter zur Prozessoptimierung. Die Ableitung der individuellen Kultivierungsstrategie ist entscheidend, denn der richtige Zeitpunkt für die Induktion, also der Umstellung von Biomasseproduktion auf Herstellung des Zielproteins, kann somit wesentlich leichter identifiziert werden.

    Das fundierte Wissen um das Prozessdesign gewinnt an Bedeutung, was sich auch an den gestiegenen Ansprüchen der behördlichen Institutionen und Aufsichtsbehörden (z. B. US Food and Drug Administration (FDA), European Medicines Agency (EMA)) an die Betreiber biopharmazeutischer Anlagen zeigt, deren Prozesse auf wissenschaftlicher Basis zu verstehen. Es gilt die Qualität des Endproduktes weiter zu steigern, diese zu garantieren und dabei die Herstellung in einem gewissen Rahmen (Design Space) flexibel gestalten zu können. Dazu müssen innerhalb der kritischen Prozessparameterbereiche (CCP) die kritischen Qualitätseigenschaften (CQA) des Produktes erfüllt werden. Diesen Forderungen kann nur genüge getan werden, wenn tiefes Verständnis für die Produktionsprozesse an der Produktionsanlage vorliegen.

    Abschließend kann zusammengefasst werden, dass durch die neue kLa-Messmethode ein weiterer Baustein zum „gläsernen“ Bioreaktor entwickelt wurde, wodurch eine verbesserte Produktqualität, -reinheit und -ausbeute erzielt werden können. Durch die erhobenen Messwerte kann der Bioprozess optimiert und in weiterer Folge der Design Space genauer definiert werden.

    Literatur

    [1]Kane J: Measuring kLa for better bioreactor performance. Bioprocess International, 2012, 10 (3), p46–49.
    [2]Linek V et al.: Analysis of differences in kLa values determined by steady-state and dynamic methods in stirred tanks. Chemical Engineering Journal 1982, 25, p77–88.
    [3]Linek V et al.: Dynamic pressure method for kLa measurement in large-scale bioreactors. Biotechnology and Bioengineering 1988, 33, p1406–1412.
    [4]Wurm, F: Production of recombinant Protein Therapeutics in cultivated mammalian cells. Nature Biotechnology 2004, 22 (11), p1393–1397.
    [5]Wong DCF et al.: Impact of dynamic online fed-batch Strategies on metabolism, Productivity and N-Glycosylation quality in CHO Cell cultures. Biotechnology and Bioengineering 2005, 89(2) p 164–177.
    [6]Goldrick S et al: Online Control of Glucose Concentration in High Yielding Mammalian Cell Cultures enabled through oxygen transfer rate measurements. Biotechnology Journal 2018, 13, 1700607.
    [7]Patentnummer A20182/2018, Status „Pending“.
    [8]Garcia-Ochoa F, Gomez E: Bioreactor scale-up and oxygen transfer rate in microbial processes: an overview. Biotechnology Advances 2009, 27, p153–176.
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