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    Abbildung 1: Sporizide Tücher (Quelle: STERIS).

    Prüfung von Desinfektionsmitteln für den Einsatz gegen Pilze am Beispiel einer ATMP-Produktion

    Reinigung & Desinfektion

    Jim Polarine jr., Dan Klein, Alexander Pfülb · STERIS Deutschland GmbH, Köln

    Korrespondenz:

    Alexander Pfülb, STERIS Deutschland GmbH, Eupener Straße 70, 50933 Köln; E-Mail: Alexander_Pfuelb@steris.com

    Jim Polarine jr.
    Jim Polarine jr. ist Senior Technical Service Manager bei der STERIS Corporation und seit 20 Jahren für das Unternehmen tätig. Er schloss sein Studium an der University of Illinois mit einem Master of Arts in Biologie ab. Zuvor arbeitete er als Manager für klinische Forschung beim Department of Veterans Affairs in St. Louis, Missouri, und als Dozent für Biologie und Mikrobiologie an der Universität von Illinois. Sein derzeitiger technischer Schwerpunkt ist die mikrobielle Kontrolle in Reinräumen und anderen kritischen Umgebungen. Er ist Mitglied der PDA-Task Force COVID-19 und der PDA-Task Force Microbial Excursions.
    Dan Klein
    Dan Klein ist derzeit als Senior Technical Service Manager bei der STERIS Corporation tätig. Er erhielt seinen Bachelor of Science in Mikrobiologie an der University of Illinois in Urbana-Champaign und seinen Master of Arts in Biologie an der Washington University in Saint Louis, Missouri. Klein verfügt über umfangreiche Erfahrung im Bereich Contamination Control, u. a. über 20 Jahre als F&E-Manager für Mikrobiologie und klinische Angelegenheiten sowie die Leitung eines Auftragslabors. Sein technisches Fachwissen umfasst die Unterstützung verschiedener Bereiche, einschließlich pharmazeutischer Anwendungen, des Gesundheitswesens und des Verteidigungsministeriums.
    Alexander Pfülb
    Alexander Pfülb ist seit 13 Jahren im Life-Sciences-Bereich in verschiedenen Positionen tätig und betreut seit 2017 bei STERIS Life Sciences Pharma- und Medizinproduktehersteller in Deutschland. Sein Fokus liegt hier auf dem Bereich Contamination Control Solutions. Dabei unterstützt er die herstellende Industrie bei Desinfektion, Prozessreinigung und Sterilisationskontrolle. Insgesamt beschäftigt er sich seit 28 Jahren mit den Themen Mikrobiologie und Hygiene.

    Zusammenfassung

    Das Auftreten von Pilz-Befunden in kontrollierten Umgebungen kann ein hartnäckiges und endemisches Problem darstellen, das zu Produktverlusten, erhöhten Herstellungskosten und außerdem zu teuren Maßnahmen führen kann, die notwendig sind, um die Kontaminationsquellen zu finden und zu entfernen. Besonders problematisch ist dies, wenn Pilze in der Herstellung von sog. Advanced-Therapy Medicinal Products (ATMPs) nachgewiesen werden, wobei spezifische personalisierte Medikamente in biologischen Sicherheitswerkbänken (BSC) in einem Reinraum verarbeitet werden. Bei jedem herstellenden Betrieb müssen das Desinfektionsverfahren und die Desinfektionsleistung im Vorfeld auf ihre Eignung geprüft werden. Dieser Beitrag umreißt die Herausforderungen, denen sich insbesondere Zell- und Gentherapieeinrichtungen gegenübersehen, und stellt experimentell belegte Ergebnisse zur Wirkung gegen wichtige Pilzisolate vor, um damit die besten Maßnahmen zur Risikominderung aufzuzeigen.

    Einleitung

    Kontaminationen mit Pilzen sind weltweit nach wie vor ein Problem in Herstellungsbetrieben im Bereich von Pharma, Biotech, Medizinprodukten, bei Cannabis-Herstellern und auch bei herstellenden Apotheken. Aspergillus, Cladosporium, Chaetomium, Acremonium und Penicillium stellen nur einige der Pilzarten dar, die im Hygienemonitoring auftreten. Einige der häufigsten Quellen waren die Rollen von Reinraumwagen, Geräte, Kunststoffbehälter, Marker, Kisten, Mobiltelefone und Werkzeuge: So wurde z. B. Aspergillus unter einem Brutschrank gefunden, der in einen Reinraumbetrieb gebracht wurde. Penicillium war eine Kontaminationsquelle auf Türen mit Wabenstruktur und auf Türen aus rostfreiem Stahl mit Sperrholz als Innenkomponente [1, 2].

    In Reinraumbetrieben werden Pilzsporen als besorgniserregende Mikroorganismen und in wiederholten Fällen als Gesundheitsrisiko eingestuft.

    Während eines kürzlichen Ausbruchs von Aspergillus-brasiliensis-Sporen in einer Einrichtung zur Herstellung von Arzneimitteln mittels neuartiger Therapien (Advanced-Therapy Medicinal Products – ATMP) wurden mehrere potenzielle Ursachen identifiziert. Darunter befanden sich Reinraum-Klebematten, übermäßiges Spülen mit Trinkwasser, falsche Verdünnungen von Desinfektionsmitteln sowie unwirksame Reinigungs- und Desinfektionspraktiken in der Sicherheitswerkbank.

    Das Auftreten von Pilzsporen bedeutet für den Reinraumbetrieb ein potenzielles Kontaminationsrisiko [3]. Mehrere Pilzarten sind pathogen und stellen ein erhebliches Gesundheitsrisiko dar [4, 5]. In jüngster Zeit gab es in der Industrie Fälle, in denen ineffektive Kontaminationskontrollstrategien zu Pilzkontaminationen in Arzneimitteln geführt haben, die zu Langzeiterkrankungen und sogar Todesfällen geführt haben [6].

    In ATMP-Einrichtungen werden neue und vielversprechende Produkte u. a. für Sichelzellenanämie, kongestive Herzinsuffizienz, Diabetes, Chorea Huntington, Krebs und viele andere chronische Krankheiten produziert.

    Mehrere ATMP-Hersteller und Compounding-Apotheken haben auf Restricted Access Barrier Systems (RABS) umgestellt, um die Mitarbeiter als Kontaminationsquelle während der Produktion zu eliminieren. Mitarbeiter sind die größte Quelle potenzieller Kontaminationen im Reinraumbetrieb – ihr Ausschluss aus dem aseptischen Prozess soll das Kontaminationsrisiko senken [7].

    RABS haben sich in den letzten 5 Jahren in der Industrie für die aseptische Produktion stark durchgesetzt, um die Wahrscheinlichkeit der Einbringung von Bioburden durch Mitarbeiter in den Produktions- und Abfüllprozess zu verringern.

    Langfristiges Ziel muss es sein, zu verhindern, dass die Pilzsporen-Kontamination in der Anlage erneut auftritt und zu Überschreitungen von Grenzwerten führt, was weitergehende Untersuchungen sowie Korrektur- und Vorbeugungsmaßnahmen (CAPA) nach sich zieht.

    Eine gängige Praxis bei CAPA-Verfahren ist die Durchführung einer gründlichen Risikobewertung, um die Wahrscheinlichkeit wiederkehrender Pilzsporen-Ausbrüche im Reinraumbetrieb zu verringern. Sporizide Desinfektionsmittel und verdampftes Wasserstoffperoxid (VHP) sind gängige Chemikalien, die in der Industrie eingesetzt werden, um großflächige Pilzausbrüche in allen Reinraumanlagen einschließlich ATMP-Anlagen zu bekämpfen. Ziel ist es, das erneute Auftreten von Pilzsporen in Reinraumanlagen proaktiv zu verhindern. Dabei ist es wichtig, das richtige Desinfektionsmittel mit der entsprechenden fungiziden Wirksamkeit zu wählen.

    Informationen zur Aktivität von Desinfektionsmitteln gegenüber Pilzen sind meist nicht sehr verbreitet. Einerseits gibt es eine unglaubliche Vielfalt innerhalb der verschiedenen Pilzklassen und andererseits einen mangelnden Fokus auf Pilze in Reinräumen, die ja auch tatsächlich im Vergleich zu Bakterien und Bakteriensporen weniger verbreitet sind, aber ebenso problematisch sein können. Zu den Pilzen zählen einzellige Hefearten, aber eben auch komplexere Eukaryonten.

    Dieser Beitrag beschäftigt sich mit Biozid-Tests gegen Pilzsporen für ATMP-Anlagen und Reinraumbetriebe.

    Reinigung und Desinfektion

    Die Reinigung und Desinfektion von Sicherheitswerkbänken bei ATMP-Herstellern sind besonders kritisch. Die routinemäßige Verwendung von Phenol- oder quartären Ammoniumdesinfektionsmitteln ist üblich.

    Phenolhaltige Desinfektionsmittel sind zwar in Europa nicht erhältlich und werden in anderen Regionen der Welt behördlich geprüft, werden aber seit Langem verwendet und wurden aufgenommen, um die in ATMP-Produktionen vorkommenden Pilze zu charakterisieren. Zum Auftragen der Chemikalien werden Sprühflaschen und Wischtücher verwendet, um eine vollständige Abdeckung und die erforderliche Kontaktzeit (nass) zu erreichen. Desinfektionsmittel, die Tenside enthalten, sind bei der U.S. Environmental Protection Agency (EPA) als Desinfektionsreiniger registriert, was bedeutet, dass sie Oberflächen sowohl reinigen als auch desinfizieren [3, 8].

    Sporizide Desinfektionsmittel wie Natriumhypochlorit oder Wasserstoffperoxid/Peressigsäure-Mischungen werden wöchentlich und in einigen Fällen täglich in den Werkbänken verwendet, um Pilz- und Bakteriensporen zu kontrollieren. Alkohole wie 70-prozentiges Isopropanol oder 70-prozentiges Ethanol sollten entweder mit Sprüh- oder Wischanwendungen verwendet werden, um eventuelle Rückstände zu entfernen. Sicherheitswerkbänke sind kritische ISO-5-Bereiche, da in diesen kleinen, kontrollierten Räumen aseptische Produktionsschritte stattfinden.

    Die Sterilitätsprüfung ist ein weiteres Verfahren, das in diesen aseptischen Umgebungen häufig durchgeführt wird. Die Reinigung dieser Bereiche mit überlappenden, unidirektionalen Wischschritten ist unerlässlich, um eine vollständige Abdeckung zu erzielen und die validierte Kontaktzeit zu erreichen, die notwendig ist, um die übliche Keimbelastung im kontrollierten Bereich abzutöten. Gebrauchsfertige Desinfektionsmittel sowie desinfizierende und sporizide Wischtücher sind effiziente, bequeme und effektive Produkte zur Reinigung und Desinfektion von Sicherheitswerkbänken in ATMP-Produktionen.

    Abbildung 1 zeigt sporizide Tücher, die nach jedem Produktionszyklus in den Sicherheitswerkbänken verwendet werden können.

    Abbildung 1: Sporizide Tücher (Quelle: STERIS).

    Abbildung 2 zeigt eine Sicherheitswerkbank. Es ist notwendig, diese täglich und nach jedem Produktionslauf oder jeder Produktionskampagne zu reinigen und zu desinfizieren. Die Innen- und Außenseite der Arbeitskammer einschließlich des Gitters müssen routinemäßig mit einem Desinfektionsmittel und einem Sporizid gereinigt werden, um jegliche mikrobielle Belastung zu beseitigen, die zu Kontaminationen führen könnte. Die Häufigkeit der Reinigung und Desinfektion hängt von der Aktivität sowie vom Risiko einer Produktkontamination ab.

    Abbildung 2: Sicherheitswerkbank (BSC) (Quelle: mit freundlicher Genehmigung von AST Labs).

    Selbst bei ordnungsgemäßen Reinigungs- und Desinfektionspraktiken unter den richtigen Einsatzbedingungen ist es notwendig, die mit den wichtigsten Kontaminanten verbundenen Herausforderungen zu verstehen. Insbesondere hartnäckige und problematische Pilzkontaminationen sollten empirisch untersucht werden, um ihre Anfälligkeiten gegenüber der Desinfektion besser zu verstehen.

    Material und Methoden

    Um die Wirksamkeit von Desinfektionsmitteln gegen verschiedene Pilzarten zu vergleichen, die in Bereichen innerhalb von ATMP-Produktionen vorhanden sein könnten, wurde eine Time-Kill-Suspensionsstudie verwendet.

    Bei dieser Methode wurde eine flüssige Suspension des Desinfektionsmittels mit einem kleinen Volumen einer vorbereiteten Stammsuspension der Pilzisolate beimpft, um die Abtötungsrate über die Zeit hinweg zu bestimmen. Die Pilzkulturen wurden auf einem herkömmlichen Pilz-Agar-Medium bei 25 °C für eine signifikante Zeitspanne von bis zu 10 Tagen gezüchtet, um eine gute Pilzsporenbildung zu gewährleisten. Die Pilzkultur wurde dann geerntet und anschließend in Kochsalzlösung mit 0,05 % Polysorbat 80 resuspendiert, mazeriert und durch sterile Glaswolle filtriert, um Hyphenelemente zu entfernen. Anschließend wurden 9,9 ml geeignetes Testprodukt mit 0,1 ml der Pilzsuspension inokuliert. Nach den entsprechenden Kontaktzeiten wurde eine Probe des beimpften Produkts entnommen und in ein ausreichendes Volumen an Neutralisationsmedium (Letheen A/T-Bouillon) gegeben, um sicherzustellen, dass alle chemischen Reaktionen zu dem auszuwertenden Zeitpunkt gestoppt wurden.

    Es wurden Neutralisationskontrollen und Neutralisator-Wirksamkeitsstudien durchgeführt [9]. Der Neutralisator enthielt Lecithin und Polysorbat 80, und es wurde gezeigt, dass er den Wirkstoff vollständig neutralisiert, um zu verhindern, dass eine Restaktivität die Log10-Reduktionswerte beeinflusst. Die Proben wurden seriell in der Neutralisationsbouillon verdünnt und die Verdünnungen auf den entsprechenden Nährmedien ausplattiert. Nach der Inkubation bei 25 °C wurde die Anzahl der überlebenden Organismen durch Keimzählung ausgewertet. Log10-Reduktionswerte wurden unter Verwendung paralleler Kontrollen berechnet, die im Butterfield-Puffer durchgeführt wurden.

    Ergebnisse

    Zur Bewertung der Wirkung von Desinfektionsmitteln gegen Pilze wurden mehrere Time-Kill-Studien durchgeführt. Die hochresistenten Spezies Aspergillus und Chaetomium wurden ausgewählt und zusammen mit einem Referenzstamm von Trichophyton interdigitale und dem Hefepilz Candida albicans getestet.

    Die erste Studie verglich 4 Pilzstämme. Das verwendete Desinfektionsmittel wurde auf der Basis eines quaternären Ammonium-Wirkstoffs formuliert. Wie aus den Daten hervorgeht, sind nicht alle Pilze gegenüber der Desinfektion gleich empfindlich. Einige Wirkstoffe zeigten eine geringe Wirksamkeit gegen schwerer abzutötende Arten, während sie eine gute Wirksamkeit gegen Hefepilze und sogar Trichophyton bewiesen. Diese Einschränkungen können durch Verbesserungen der Formulierung überwunden werden – einschließlich der Verwendung von Hilfsstoffen, die den Kontakt und die Penetration der Pilzsporen unterstützen (Abb. 3).

    Abbildung 3: Time-Kill-Studie mit verschiedenen Pilzen unter Verwendung einer Formulierung auf Basis einer quaternären Ammoniumverbindung (Quelle: STERIS).

    In der nächsten Studie wurde der Aspergillus-Stamm ATCC 16404 weiter untersucht und direkt mit einem Chaetomium-glabosum-Isolat verglichen (Abb. 4).

    Abbildung 4: Time-Kill-Studie mit einem phenolischen Desinfektionsmittel (Quelle: STERIS).

    Die Daten zeigten, dass ein formuliertes alkalisch-phenolisches Desinfektionsmittel eine Wirksamkeit mit mehr als einer doppelten Log10-Reduktion gegen den schwer abzutötenden Stamm Aspergillus brasiliensis (ATCC 16404) bei einer 10-minütigen Kontaktzeit besitzt. Jedoch zeigt es eine minimale Wirksamkeit gegen ein sehr geringes Challenge-Inokulum von Chaetomium globosum (ATCC 6205) bei den gleichen Kontaktzeiten unter Verwendung der gleichen Methodik. Die Ausgangszahlen waren 5,90 Log10 für A. brasiliensis und 2,65 Log10 für C. globosum.

    Diese Daten deuten darauf hin, dass C. globosum schwierig zu kultivieren ist, zu niedrigeren als den gewünschten anfänglichen Inokulumniveaus führen kann, und dass die Desinfektion in Reinräumen in ATMP-Produktionen von Natur aus schwierig sein kann.

    Aufgrund der Variabilität, die bei verschiedenen Pilzarten zu beobachten ist, ist es wichtig, ein Sporizid als Teil jedes Desinfektions-Rotationsprogramms einzusetzen. Sporizide wurden entwickelt, um selbst die schwierigsten bakteriellen Sporen abzutöten, die resistenter sind als die am schwersten abzutötenden Pilzarten. Sporizide bieten ein hohes Maß an Wirksamkeit und stellen sicher, dass es zu keiner Pilzproliferation kommt (Abb. 5).

    Abbildung 5: Time-Kill-Methode mit einem formulierten alkalisch-phenolischen Desinfektionsmittel vs. Sporiziden A. brasiliensis ATCC 16404, Ausgangswert = 5,88.

    In dieser Studie zeigt das Sporizid, das Peressigsäure und Wasserstoffperoxid enthält, eine ausgezeichnete antimykotische Wirksamkeit und weist eine signifikante Steigerung der antimykotischen Wirksamkeit im Vergleich zu einem alkalisch-phenolischen Desinfektionsmittel auf.

    Diskussion

    Betreiber von Reinräumen berichten häufig über ein wiederholtes Auftauchen verschiedener Pilzarten während des routinemäßigen Umgebungsmonitorings. Diese Pilzstämme können mehrere Quellen haben. Sie sind typischerweise keine menschlichen, kommensalen Mikroorganismen, sondern stammen aus der Umwelt und können durch bewegbare Gegenstände, Wagen oder andere nicht lebende Vektoren in einen Reinraum gelangen. Diese Pilze können aufgrund von Unkenntnis und Bedenken hinsichtlich der Wirksamkeit verschiedener formulierter Desinfektionsmittel Anlass zur Sorge geben.

    In diesen Studien wurden mehrere Isolate verschiedener Pilzarten untersucht, um festzustellen, ob bei der Reinigung und Desinfektion besondere Überlegungen angestellt werden müssen. Die Auswahl der richtigen Testmethode und deren korrekte Durchführung können die Ergebnisse drastisch beeinflussen und möglicherweise zu einer Über- oder Unterschätzung der relativen Anfälligkeit der getesteten Pilze führen.

    Fungizide Tests

    Die Durchführung von Studien zur Charakterisierung der Wirksamkeit von Desinfektionsmitteln und Sporiziden gegen Pilzstämme ist in einem mikrobiologischen Labor wichtig, um ein geeignetes Desinfektionsprogramm zu erstellen. Dabei sollten Produktionsverantwortliche die Schlüsselvariablen kennen, die das Ergebnis der Prüfung beeinflussen. Diese Kenntnis ist unerlässlich, wenn die Wirksamkeit von Desinfektionsmitteln gegen Pilze getestet werden soll, die in bestimmten Bereichen vorkommen und normalerweise nicht als Teil des Produktregistrierungsprozesses charakterisiert werden oder atypisch im Vergleich zu den problematischen Pilzen sind, die häufig aus Reinraumumgebungen isoliert werden. Die Kenntnis der Schlüsselvariablen verbessert die Fähigkeit, die Tests erfolgreich durchzuführen und aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten, die den Dekontaminationsprozess unterstützen können.

    Es ist entscheidend, ein geeignetes Pilzisolat auszuwählen. Ebenso muss man in der Lage sein, einen ausreichenden Titer des Pilzstammes erfolgreich zu kultivieren und zu züchten, um die Kultur so vorzubereiten, wie es für die Prüfung der Desinfektionsmittelwirksamkeit erforderlich ist. Zudem sollte eine geeignete Testmethode ausgewählt werden, die Variablen wie Testprodukt, Testoberfläche (falls vorhanden) und Kontaktbedingungen (Zeit und Temperatur) umfasst.

    Das Verfahren zur Prüfung der Wirksamkeit von Desinfektionsmitteln ist äußerst komplex – wie die meisten wissenschaftlichen Versuche. Es lässt sich jedoch wie folgt zusammenfassen:

    • Züchten des Challenge-Mikroorganismus

    • Beimpfen einer repräsentativen Testoberfläche

    • Aussetzen des Challenge-Mikroorganismus gegenüber einem Desinfektionsmittel für eine festgelegte Kontaktzeit

    • Neutralisieren der Desinfektionsmittelaktivität

    • Auszählen der überlebenden Mikroorganismen und Vergleich mit einer Ausgangswertkontrolle

    • Berechnung eines Log10-Reduktionswerts und Bestimmung der Effektivität anhand vorgegebener Akzeptanzkriterien

    Jeder dieser Schritte muss jedoch sorgfältig überlegt sein. Fehler bei der Neutralisation können z. B. die beobachtete Wirksamkeit einer Formulierung drastisch überbewerten. Außerdem können Pilzarten im Labor überraschend schwierig zu kultivieren sein. Arten wie Chaetomium glabosum können sehr spezifische Nährstoffbedürfnisse haben, und selbst bei sorgfältiger Medienauswahl können die im Labor erzielten Titer zu niedrig sein, um ein genaues Verständnis der Wirksamkeit zu erhalten. Bei anderen Arten, einschließlich Hefen wie Candida albicans, kann sich während des Trocknungsprozesses, der zur Vorbereitung auf den Test notwendig ist, der Titer reduzieren. Diese Variablen müssen bei der Auswahl eines Stammes für die Prüfung berücksichtigt werden. Es ist wichtig, einen Titer von 105 oder mehr KBE/ml zu erreichen, um geringe Inokulumvolumina und Nachweisgrenzen zu berücksichtigen.

    Selbst wenn ein ausreichender Titer erreicht wird, ist die Kultur noch nicht testfähig. Das in der Pilzsporenkultur vorhandene Myzel kann die Wirksamkeit verfälschen, indem bei einigen Pilzen die antimikrobielle Aktivität abgeschwächt wird. Die Mazeration der Kultur mit anschließender Filtration durch sterile Glaswolle kann bei der Entfernung dieser Hyphenelemente hilfreich sein, um sicherzustellen, dass nur die Ergebnisse der Pilzsporen ausgewertet werden.

    Sobald eine Kultur erfolgreich vorbereitet wurde, gibt es eine unbegrenzte Anzahl von Testprotokollen, aus denen ausgewählt werden kann. Während ein einfacher Suspensionstest (wie die in dieser Analyse verwendeten Time-Kill-Bewertungen) ein schnelles und nützliches Werkzeug zur Bestimmung der vorläufigen Wirksamkeit und allgemeinen Empfindlichkeit sein kann, spiegelt dieser Test nicht die reale Anwendung wider.

    Bei der Prüfung von Desinfektionsmitteln für den Einsatz in bestimmten Märkten wird häufig eine Modifikation der USP <1072> gewählt [8]. Bei dieser Methode wird eine vorbereitete Testkultur eines Isolats verwendet, das als potenziell problematisch für die Umgebung eingestuft wird, in der es vorkommt. Oberflächen, die für diese kritische Umgebung charakteristisch sind, werden dann als Prüfkörper vorbereitet, auf die das Inokulum aufgebracht wird, um die Wirksamkeit eines Desinfektionsmittels zu testen.

    Pilzempfindlichkeit

    Nicht alle Desinfektionsmittel sind gleich wirksam gegen Pilze und Pilzsporen. Sporizide, die zur Abtötung von bakteriellen Sporen entwickelt wurden, zeigen i. d. R. auch Wirksamkeit gegen Pilze und Pilzsporen; ihre Verwendung kann jedoch in manchen Umgebungen eingeschränkt sein. Es ist wichtig, bei der Auswahl eines zu testenden Desinfektionsmittels die verschiedenen Pilzklassen zu bewerten, um sicherzustellen, dass das richtige Produkt getestet und keine Zeit damit verschwendet wird, ein wahrscheinlich unwirksames Produkt zu bewerten. Der Vergleich von Pilzen muss auf der Basis ihrer Anfälligkeit für die Desinfektion auf der Grundlage physikalischer Merkmale der Pilze und nicht nur auf taxonomischen Klassifizierungen erfolgen.

    Einzellige Pilze, wie die Hefe Candida, werden leichter abgetötet als die eukaryotischen Pilze und die Konidien dieser fadenförmigen Arten. Während der Vergleich mit anderen Spezies aufgrund zahlreicher Faktoren unterschiedlich ausfallen kann, stellen im Allgemeinen die Aspergillus- und Chaetomium-Spezies die größte Herausforderung für die Desinfektion dar (Tab. 1) [10].

    Es gibt immer wieder Hinweise darauf, welche Pilzspore am wenigsten empfindlich auf Desinfektion reagiert, und es ist schwierig, Pilze empirisch zu vergleichen [11]. Pilzsporen haben sich so entwickelt, dass sie in die Umwelt freigesetzt werden, erhebliche Entfernungen zurücklegen und ein neues eukaryotisches System auf einer alternativen Nährstoffquelle etablieren. Sie sind von Natur aus so gestaltet, dass sie selbst unter widrigen Bedingungen überleben.

    Einige häufig isolierte Pilze, die nachweislich in ATMP-Produktionen vorkommen, sind in Tab. 1 aufgeführt. Die relative Anfälligkeit der verschiedenen Pilzgattungen ist sehr von mehreren Faktoren abhängig und kann je nach verwendetem Desinfektionsmittel entsprechend stark variieren. Auf der Grundlage von Beobachtungsdaten kann jedoch eine relative Hierarchie der Empfindlichkeit erstellt werden, die als allgemeiner Leitfaden zur Beurteilung der potenziellen Desinfektionsherausforderung dient.

    Tabelle 1

    In ATMP-Produktionen häufig vorkommende Pilze.

    Widerstandsfähiger

    Weniger widerstandsfähig

    Pilzarten

    Chaetomium spp

    Aspergillus spp

    Penicillium spp

    Cladosporium spp

    Trichophyton spp

    Candida spp

    Es ist auch erwähnenswert, dass es keine echten Beispiele für unterschiedliche Sporen- und vegetative Formen von Pilzen gibt. Im Gegensatz zu bakteriellen Sporen haben die eukaryotischen Pilze nicht sowohl einen vegetativen als auch einen Sporenstatus, sondern einen Fruchtkörper, der sich als äußerst resistent gegen Umweltfaktoren und Desinfektion erweisen kann. Beim Testen von Pilzen ist es wichtig, das Challenge-Inokulum richtig vorzubereiten, um sicherzustellen, dass der Test repräsentativ für eine wirklichkeitsgetreue Herausforderung ist.

    Natürlich müssen beim Vergleich von Pilzarten und ihrer Anfälligkeit für die Desinfektion auch andere Faktoren berücksichtigt werden. Bei Desinfektionstests sind nicht alle Dinge gleich, und Faktoren wie die Größe des Inokulums, die Auswahl der Methode und sogar die Auswahl des Desinfektionsmittels können es sehr erschweren, relative Empfindlichkeiten zu verstehen.

    Schlussfolgerung

    Pilzsporen-Ausbrüche sind nach wie vor ein Problem in der Reinraumindustrie, das dadurch hervorgehoben wird, dass es sich bei diesen Sporen um pathogene und unerwünschte Mikroorganismen handeln kann. Pharma-, Biotech-, Medizinprodukte-, ATMP-Unternehmen sowie herstellende Apotheken wenden viel Zeit und Ressourcen auf, um Quellen für Pilzsporen zu finden. Ein biozider Wirkstoff, der gegen Pilzsporen wirksam ist, ist unerlässlich und ermöglicht es Reinraumbetrieben, den Ausbruch von Pilzsporen zu kontrollieren, sobald die Quellen identifiziert sind. Um eine Pilzsporen-Kontamination oder einen Ausbruch in einem Reinraumbetrieb zu bekämpfen, wird typischerweise ein Sporizid empfohlen. Das langfristige Ziel ist ein Kontaminationskontrollprogramm, das proaktiv das Auftreten von Pilzsporen in der Produktionsumgebung verhindert.

    Daher wurde eine Reihe von Desinfektionsmittel-Suspensionstests durchgeführt, um verschiedene Klassen von Pilzen, die in dieser Branche auftreten können, vorab zu charakterisieren, um die Programmauswahl und -modifikation zu unterstützen, wenn bestimmte Umweltisolate festgestellt werden.

    Danksagung

    Die Autoren bedanken sich bei der STERIS Corporation, R&D Microbiology Laboratory für die wertvolle Bereitstellung von Daten.

    Literatur

    [1]Polarine, J., Macauley, J., Karanja, P., Klein, D., Martin, A. (2009) Evaluating the Activity of Disinfectants Against Fungi. Cleanrooms: The Magazine of Contamination Control Technology 23(2).
    [2]Carol Bartnett, Jim Polarine and Paul Lopolito (2007). Control Strategies for Fungal Contamination in Cleanrooms.
    [3]McDonnell, G.E. (2007) Antisepsis, Disinfection, and Sterilization: Types, Action, and Resistance. Washington, D.C., ASM Press.
    [4]Sandle, et. al. In vitro fungicidal activity of biocides against pharmaceutical environmental fungal isolates. J. Applied Micro. 117, 1267–1273.
    [5]McDonnell, G., and Hansen, J., Block’s Disinfection, Sterilization, and Preservation, sixth edition 2021.
    [6]New England Compounding Pharmacy Warning Letter https://www.fda.gov/media/84684/download (zuletzt abgerufen am 02.09.2021).
    [7]Sandle, Tim. A Review of Cleanroom Microflora: Types, Trends, and Patterns. PDA Journal, 65, 392–403, 2011.
    [8]United States Pharmacopoeia (USP) (2021) General Information Chapter <1072>, Disinfectants and Antiseptics. The United States Pharmacopeial Convention/National Formulary, Rockville, MD.
    [9]ASTM E2315-16. Standard Guide for Assessment of Antimicrobial Activity Using a Time-Kill Procedure, ASTM International, West Conshohocken, PA.
    [10]Mattei, et. al. In vitro activity of disinfectants against Aspergillus spp. Brazilian Journal of Microbiology. 44, 2, 481–484 (2013).
    [11]Van de Voorde, et. al. The Choice of Fungi as Test Organisms in Disinfectant Testing. Zbl. Bakt. Hyg., 179, 125–129 (1984).

    Key Words: Desinfektion, ATMP, Hygiene, Contamination Control Strategy

    Originaldokument