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    Abbildung 1: Dotplot eines Durchflusszytometers (Quelle aller Abbildungen: BWT AQUA AG).

    Beispiele zum Einsatz von mikrobiologischen Schnellmethoden

    Umsetzung der Kontaminationskontrollstrategie des GMP-Annex 1

    Technik

    Felix Thiele · BWT AQUA AG, Aesch (Schweiz)

    Korrespondenz:

    Felix Thiele, BWT AQUA AG, Hauptstrasse 192, 4147 Aesch (Schweiz); E-Mail: felix.thiele@bwt-aqua.ch

    Felix Thiele
    Felix Thiele machte 2011 seinen Abschluss in Umwelttechnologie (B.Eng). 2015–2017 absolvierte er ein Masterstudium an der FHNW in Environmental Technologies. 2017 reichte er seine Masterthesis zum Thema „Einsatz von Antiscalant in kaltem WFI“ für BWT AQUA AG ein. Seit Ende 2017 arbeitet als Produktmanager für Analysetechnik bei BWT AQUA AG.

    Zusammenfassung

    Wasser ist der wichtigste Hilfsstoff der pharmazeutischen Industrie. Die Überprüfung der mikrobiologischen Reinheit des gereinigten Wassers ist ein wichtiger Bestandteil der Qualitätskontrolle in der pharmazeutischen Produktion. Traditionell wird dies mit dem Plattentest durchgeführt – ein Verfahren, das in den Grundzügen bereits seit 130 Jahren existiert [1]. Der letzte Entwurf des GMP-Annex 1 aus dem Jahre 2020 weist deutlich auf den Begriff der ganzheitlichen Kontaminationskontrollstrategie (Contamination Control Strategy, CCS) hin und hebt dabei auch den Einsatz von mikrobiologischen Schnellmethoden (engl. rapid microbiological methods, RMM) hervor. Mit RMM können Prozessabläufe und Standard Operating Procedures (SOP) mit geringem Aufwand mikrobiologisch bewertet und entsprechend verbessert werden. Sie können somit zur Umsetzung der CCS des GMP-Annex 1 beitragen.

    1. Einleitung

    1.1 Mikrobiologische Überwachung von PW und WFI

    Wasser ist der wichtigste Hilfsstoff der pharmazeutischen Industrie und wird mehrheitlich in den Qualitätsstufen Reinwasser (engl. Purified Water, PW) und Wasser für Injektionszwecke (WFI) verwendet. Es kommt dabei sowohl für Spülprozesse wie auch in sterilen und nicht-sterilen Produkten zum Einsatz. Die Qualitätskontrolle erfolgt anhand mehrerer Parameter, die in den Pharmakopöen definiert sind [2, 3].

    Der mikrobiologischen Untersuchung kommt dabei eine Sonderrolle zu, da es sich dabei um den Parameter der Qualitätskontrolle handelt, der auch heutzutage mehrheitlich manuell bestimmt wird. Während andere Parameter (wie die Leitfähigkeit oder der TOC) kontinuierlich innerhalb des Prozesses kontrolliert werden, werden Proben für die Mikrobiologie einzeln an definierten Probenahmestellen entnommen.

    Für die Durchführung der Arzneibuchmethode, auch Plattentest genannt, wird die Probe durch eine Membran filtriert. Es folgt eine Inkubationszeit von 5 Tagen auf einem Nährmedium und die wiederum manuelle Auszählung der koloniebildenden Einheiten (KBE). Dementsprechend ist die Reaktionszeit im Falle mikrobiologischer Kontaminationen lang und im Falle kritischer Prozesse oder teurer Produkte zu lang.

    Aus diesen und weiteren Gründen wächst das Interesse an Rapid Microbiological Methods (RMM) im Markt in den letzten Jahren spürbar, was auch am Zusammenschluss von unternehmensübergreifenden Interessengruppen und Veröffentlichungen der Online Water Bioburden Analysis (OWBA) zu erkennen ist [4]. Auch anbietende Unternehmen nehmen die Erhöhung der Anzahl der Anfragen zum Thema RMM deutlich wahr.

    Das verstärkte Interesse an dem Thema auf der Seite der Anwender wird sicherlich auch durch die Herausgabe von Dokumenten von offizieller Seite verstärkt. So haben alle größeren Pharmakopöen und weitere pharmazeutisch relevante Institutionen entsprechende Dokumente bzw. Leitfäden veröffentlicht – z. B. Parenteral Drug Association (PDA), European Pharmacopoeia (Ph. Eur.), United States Pharmacopeia (USP) und European Medicines Agency (EMA). So weist z. B. der rege diskutierte Entwurf des GMP-Annex 1 aus dem Jahre 2020 deutlich verstärkt auf den Begriff der Contamination Control Strategy (CCS) hin und hebt dabei auch den Einsatz von RMM hervor. Entsprechend des Dokuments soll die Effektivität aller Kontrollmechanismen (technisch wie organisatorisch) regelmäßig überprüft werden. Zudem soll eine kontinuierliche Verbesserung angestrebt werden. Moderne Methoden sollen für diesen Zweck in Erwägung gezogen und auf ihre Anwendbarkeit überprüft werden [5].

    1.2 RMM im pharmazeutischen Markt

    Aus eigener Perspektive kann jeder Leser nachvollziehen, dass die Patientensicherheit und damit die Produktsicherheit von höchster Wichtigkeit für die pharmazeutischen Unternehmen ist. Produktrückrufe aufgrund von mikrobiologischen Verunreinigungen sind, trotz aller Vorkehrungen, ein weiterhin vorkommendes Problem und weiterhin eine der größten Herausforderungen der pharmazeutischen Industrie [6]. Bestehende Prozesse zur Validierung von Methoden sind demnach sehr wichtig und offensichtlich begründbar, führen allerdings auch zu zeitintensiven Beurteilungsprozessen. Hier können die Hersteller der RMM die Anwender mit den Daten der Primärvalidierung unterstützen, um deren internen Aufwand zu reduzieren und die Validierung zu vereinfachen und zu beschleunigen.

    Eine weitere Herausforderung sind sicherlich auch die unterschiedlichen Einheiten der RMM im Vergleich zu der Arzneibuchmethode, was allerdings von den Pharmakopöen nicht als Problem angesehen wird [7, 8]. In diesem verständlich konservativen Umfeld setzen sich Innovationen nur langsam durch und der einzige Weg zur Etablierung von neuen Methoden ist über Gerätetests. Auch diese Tests sind mit internem Aufwand verbunden und häufig ist unklar, wie man RMM am sinnvollsten einsetzen und testen kann. Der folgende Text gibt eine Übersicht über die verschiedenen Möglichkeiten für den Einsatz von RMM. Die Beispiele zeigen auf, wieviel sinnvolle Zusatzinformation man mit einer RMM generieren kann und wie man dadurch die vom GMP-Annex 1 geforderte CCS unterstützen kann.

    2. Einsatzmöglichkeiten von RMM

    Eine der Fragen in der Diskussion um RMM ist, in welcher Form diese eingesetzt werden sollten. Die am häufigsten diskutierten Einsatzmöglichkeiten sind die Verwendung zur Produktfreigabe oder als zusätzliches Monitoring parallel zur Arzneibuchmethode. Beide Einsatzformen werden generell von relevanten Dokumenten unterstützt, wobei die Messgeräte vor dem Einsatz einer Primärvalidierung unterzogen werden sollten [8]. Aufgrund der bisher geringen Verbreitung ist für beide Einsatzformen im Markt bisher wenig Erfahrung vorhanden, wenn man dies z. B. mit der Online-Messung von Total Organic Carbon (TOC) vergleicht.

    Abgesehen von den beiden oben erwähnten Varianten gibt es noch die bisher weniger diskutierten Möglichkeiten zur Prozess- und Anlagenoptimierung. Dabei ist das Ziel nicht, die Einhaltung eines definierten Grenzwertes zu überwachen, sondern vielmehr der gezielte Einsatz von RMM in definierten Situationen oder während bestimmter Verfahrensschritte, um diese mikrobiologisch besser beurteilen und anschließend verbessern zu können. In den folgenden Abschnitten werden die angesprochenen Möglichkeiten einzeln diskutiert und z. T. mit Beispielen aus internen Versuchen veranschaulicht. Als RMM kam ein Durchflusszytometer zum Einsatz, welches automatisiert die Zellen mit einem DNS-spezifischen Farbstoff anfärbt. Anschließend wird die Anzahl der Zellen gezählt und als „Intaktzellzahl/ml“ bzw. „ICC/ml“ ausgegeben. Die Ergebnisse stammen von einer nicht qualifizierten Versuchsanlage und stellen nicht die erwartbare Qualität einer Reinstwasseranlage im optimalen Betrieb dar.

    2.1 Produktfreigabe nach vollständiger Validierung

    RMM können zur Produktfreigabe verwendet werden, wenn diese einer Primärvalidierung durch den Hersteller unterzogen wurden [8]. Dabei ist zu beachten, dass laut der USP im Streitfall immer noch der Plattentest als die Referenzmethode herangezogen wird [7]. Im Anschluss an die Primärvalidierung müssen ein Eignungstest (engl. suitability testing) und Äquivalenztests (engl. equivalence testing) durch den Anwender durchgeführt werden [8]. Der Eignungstest stellt sicher, dass die Produkteigenschaften (z. B. der geringe Salzgehalt im Falle von WFI) keinen negativen Einfluss auf die Messqualität haben.

    Im Zuge des Äquivalenztests werden die Arzneibuchmethode (Plattentest) und die neue Methode (RMM) direkt miteinander verglichen, um zu überprüfen, ob diese statistisch gleich sind. Dazu können zum einen Daten der Primärvalidierung herangezogen werden und die statistischen Parameter verglichen werden und/oder beide Methoden können zeitgleich auf Realproben angewendet werden [8]. Auch wenn die Ph. Eur. den Äquivalenztest beschreibt, scheint laut Experten für die Validierung von RMM ein einseitiger Nichtunterlegenheitstest (engl. non-inferiority test) sinnvoller zu sein [9]. Dieser zieht auch die Möglichkeit in Betracht, dass die RMM der Arzneibuchmethode überlegen ist, da z. B. eine nicht wachstumsbasierte Methode möglicherweise mehr Zellen detektiert als auf einer Agarplatte ausgezählt werden.

    Abschließend muss der Anwender auf Grundlage der durch die Studie erhaltenen Daten neue Grenzwerte in der Einheit der RMM zur Freigabe des Produkts bzw. Wassers vorschlagen und anwenden [5, 7]. Nach Durchführung der entsprechenden Tests könnte eine RMM kontinuierlich oder manuell eine oder mehrere Probenahmestellen überwachen, und die Freigabe des Wassers kann in Echtzeit erfolgen.

    2.2 RMM als zusätzliches Monitoring

    Alternativ zum obigen Beispiel kann man RMM auch als zusätzliches Monitoring einsetzen, um eine lückenlose mikrobiologische Überwachung der Reinstwasseranlage zu gewährleisten. Es wurden bereits 2 Beispiele veröffentlicht, in denen Anwender mit den Zusatzinformationen durch die kontinuierliche Überwachung eine mikrobiologische Veränderung im Prozess feststellen konnten [10, 11]. In beiden Fällen konnte dies anhand anderer Daten erst im Nachhinein festgestellt und anschließend korrigiert werden. Dies zeigt, dass eine kontinuierliche Überwachung mit RMM in kritischen Bereichen definitive Vorteile hat, da Probleme früher erkannt und umgehend behoben werden können. Abgesehen von der kontinuierlichen Überwachung einer Anlage bieten sich allerdings noch weitere sehr interessante und in ihren Auswirkungen sehr relevante Möglichkeiten für den Einsatz von RMM.

    2.3 Beurteilung von SOPs und Betriebsweisen durch RMM

    SOPs sind Anweisungen, die den exakten Ablauf der Arbeitsvorgänge und deren Dokumentation festhalten. SOPs werden erstellt, damit Arbeiten auf eine eindeutige Art und Weise durchgeführt werden können. Dadurch wird die Sicherheit erhöht und die Ergebnisse sind klar zu beurteilen. Zur eingangs beschriebenen manuellen Probenahme für mikrobiologische Proben bestehen in pharmazeutischen Unternehmen SOPs. Diese beinhalten in den meisten Fällen eine Reinigung und einen Spülschritt der Probenahmestelle, um eine Kontamination der Probe durch an der Probenahmestelle anhaftende Zellen zu vermeiden. Dadurch wird sichergestellt, dass die Probe den Zustand des Wassers innerhalb der Anlage reflektiert und nicht den Zustand der Probenahmestelle. Auch Wartungs- und Reinigungsarbeiten sind in SOPs definiert.

    2.3.1 Beurteilung der SOP zur Probenahme

    Während des Betriebs einer Versuchsanlage wurde eine Erhöhung der mit einem Durchflusszytometer gemessenen Intaktzellzahl über 4 Wochen hinweg beobachtet. Um die Frage zu beantworten, ob die mikrobiologische Belastung der Proben durch eine Kontamination der Probenahmestellen verursacht wurden oder ihren Ursprung innerhalb der Anlage hatten, wurde ein Experiment durchgeführt. Dabei wurde – der SOP folgend – an jeder Probenahmestelle eine Probe entnommen und mit dem Durchflusszytometer analysiert. Anschließend wurde jede Probenahmestelle abgeflammt und die bisherige SOP und Probenahme ein weiteres Mal durchgeführt.

    Es zeigte sich, dass das zusätzliche Abflammen die Intaktzellzahl an allen Probenahmestellen deutlich reduzierte. Abbildung 1 beinhaltet die Ergebnisse des Durchflusszytometers. Der linke Teil der Abb. zeigt das Ergebnis vor dem Abflammen der Probenahmestelle und der rechte Teil das Ergebnis nach dem Abflammen. Dabei sind die Punkte innerhalb des roten Polygons Bakterien. Abbildung 2 veranschaulicht die Zusammenfassung der Mittelwerte aller Probenahmestellen. Von links nach rechts entsprechen die Ergebnisse der Probe nach der Ultrafiltration (WFI), nach der Elektrodeionisation (EDI), nach der zweiten Stufe der Umkehrosmose (P2), nach der ersten Stufe der Umkehrosmose (P1) und des Konzentrats nach der zweiten Stufe der Umkehrosmose (C2). Dabei ist zu erkennen, dass der Effekt an allen Probenahmestellen auftrat und durch den Einsatz der RMM sofort erkennbar war. Damit konnte der Nachweis erbracht werden, dass die bisherige SOP zur Probenahme nicht ausreichend war und entsprechend angepasst werden muss. Mit der Arzneibuchmethode wäre dieser Effekt erst nach 5 Tagen erkennbar gewesen.

    Abbildung 1: Dotplot eines Durchflusszytometers (Quelle aller Abbildungen: BWT AQUA AG).
    Abbildung 2: Ergebnisse des Durchflusszytometers vor und nach Abflammen der Probenahmestellen.

    Gerade in Situationen, in denen die Kontaminationsquelle unklar ist, haben RMM einen deutlichen Vorteil bzgl. einer beschleunigten Fehlersuche. So kann z. B. beim Feststellen einer Grenzwertüberschreitung mit der Arzneibuchmethode und einer Vergleichsmessung mit einer RMM vor und nach der Korrekturmaßnahme sofort die Effektivität der Maßnahme beurteilt werden.

    Wie vom GMP-Annex 1 gefordert, können durch den Einsatz von RMM als Teil der CCS Arbeitsabläufe mit geringem zeitlichem Aufwand auf ihre Effektivität geprüft und somit kontinuierlich verbessert werden.

    2.3.2 Beurteilung der SOP zum Anlagenbetrieb

    Die Betriebsweise einer Anlage kann einen Einfluss auf die mikrobielle Belastung des produzierten Wassers haben. Innerhalb eines Versuchs wurde erörtert, ob das Stoppen und Starten nach einem nur kurzen Stillstand die mikrobiologische Qualität des produzierten Wassers eines Erzeugers beeinflussen kann. Durch dieses Vorgehen kann z. B. bestimmt werden, wie lange Wasser nach dem Wechsel der Betriebsweise verworfen werden muss. Zudem können die Menge an Verwurf auf ein Minimum optimiert und damit Ressourcen eingespart werden.

    Zur Durchführung des Versuchs wurde die Erzeugeranlage kontinuierlich betrieben. Es wurden manuelle Proben an allen Probenahmestellen entnommen. Nach der Probenahme wurde die Anlage gestoppt. Nach 30 min wurden die Anlage wieder gestartet und nach kurzem Vorspülen eine zweite Probe an allen Probenahmestellen entnommen. Die Proben wurden manuell mit einem Durchflusszytometer im Triplikat gemessen.

    Abbildung 3 zeigt die Mittelwerte der Proben vor und nach dem Stillstand. Von links nach rechts entsprechen die Ergebnisse der Probe nach der Ultrafiltration (WFI), nach dem Elektrodeionisation (EDI), nach der zweiten Stufe der Umkehrosmose (P2), nach der ersten Stufe der Umkehrosmose (P1), des Konzentrats nach der zweiten Stufe der Umkehrosmose (C2), vor der zweiten Stufe der Umkehrosmose (MW2), vor der ersten Stufe der Umkehrosmose (MW1) und des Konzentrats nach der ersten Stufe der Umkehrosmose (C1). Es ist zu erkennen, dass die Messwerte vor dem Stillstand der Anlage an allen Probenahmestellen niedriger sind als nach dem Neustart der Anlage. Es ist davon auszugehen, dass das erneute Starten des Erzeugers durch die Scherkräfte der Überströmung an den Membranen und den Rohrleitungen Zellen abgelöst hat und diese anschließend in den Proben zu finden sind. Weiter ist aus den Ergebnissen zu schließen, dass auch auf der „sauberen“ Seite des Erzeugers (nach den Umkehrosmosemembranen) ein Biofilm vorhanden war.

    Abbildung 3: Ergebnisse eines Durchflusszytometers des Stopp/Start-Versuchs.

    Allgemein ist davon auszugehen, dass sich in den Rohrleitungen und auch auf den Membranen einer Anlage Bakterien befinden. Der Begriff der VBNC (engl. viable-but-non-culturable; dt. lebensfähig, aber nicht kultivierbar) hat sich in den letzten Jahren im Zuge der Diskussion um die RMM verbreitet. Er beschreibt das Phänomen, dass Zellen mit nicht wachstumsbasierten Verfahren in Proben nachgewiesen werden können, die – mit der Arzneibuchmethode bestimmt – als zellfrei gelten würden [12, 13]. Gerade mit diesem Hintergrundwissen ergibt der Einsatz von RMM Sinn, um Betriebsweisen gezielt zu beleuchten und zu optimieren.

    2.3.3 Beurteilung der SOP zur Sanitisierung

    Wie in einem vorherigen Beitrag gezeigt wurde, kann man RMM für die Beurteilung des Sanitisierungseffekts einer membranbasierten Anlage einsetzen [14]. In dem erwähnten Versuch wurde eine Messstelle kontinuierlich überwacht. In dem hier beschriebenen Versuch wurden manuelle Proben vor und nach der Heißwassersanitisierung an allen Messstellen der Anlage entnommen und im Triplikat gemessen.

    Die Mittelwerte der Ergebnisse des RMM sind in Abb. 4 dargestellt. Von links nach rechts entsprechen die Ergebnisse der Probe nach der Ultrafiltration (WFI), nach dem Elektrodeionisation (EDI), nach der zweiten Stufe der Umkehrosmose (P2), nach der ersten Stufe der Umkehrosmose (P1), des Konzentrats nach der zweiten Stufe der Umkehrosmose (C2), vor der zweiten Stufe der Umkehrosmose (MW2), vor der ersten Stufe der Umkehrosmose (MW1) und des Konzentrats nach der ersten Stufe der Umkehrosmose (C1). Es ist zu sehen, dass die Messstellen P1, P2, C2 und MW2 eine deutliche Reduktion der Intaktzellzahl nach der Sanitisierung zeigen. An den Messstellen WFI, EDI, MW1 und C1 konnte hingegen einer Erhöhung der Intaktzellzahl beobachtet werden.

    Abbildung 4: Ergebnisse eines Durchflusszytometers des Sanitisierungsversuchs.

    Durch diesen Versuch konnte gezeigt werden, dass die Sanitisierung zwar membranseitig (im Bereich der Umkehrosmose) ausreichend war. Die Messstellen WFI und EDI wurden jedoch nicht vollständig sanitisiert. Da sich die beiden Messstellen am weitesteten vom Heizer entfernt befinden, ist anzunehmen, dass die Temperatur dort nicht in einem Maß anstieg, das ausreichte, um alle Zellen abzutöten, und möglicherweise die Überströmung zu gering war. Der Anstieg der Intaktzellzahl in den Proben WFI, EDI, MW1 und C1 wurde vermutlich durch das Herausspülen von durch die Sanitisierung abgelöster und nicht vollständig abgetöteter Zellen verursacht. Auch hier liefert die Theorie der VBNC einen Erklärungsansatz.

    Durch diesen Versuch konnte ereignisnah der Prozess der Heißwassersanitisierung über die gesamte Anlage hinweg kontrolliert und beurteilt werden. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Anlage nicht optimal eingestellt war und dass der Versuch mit angepassten Sanitisierungsparametern wiederholt werden sollte. In diesem Kontext sollte ein weiteres Mal erwähnt werden, dass es sich hierbei um Ergebnisse einer Versuchsanlage handelt und diese aus technischer und mikrobiologischer Sicht nicht den Herstellungsstandards eines kommerziellen WFI-Erzeugers entspricht.

    Der GMP-Annex 1 fordert, dass Wasser nach der Regeneration oder Desinfektion (und somit auch nach der Sanitisierung) getestet werden sollte, bevor es für die Produktion wieder freigegeben wird [5]. Nach Wartungs- und Umbauarbeiten ist eine mikrobiologische Untersuchung vor Freigabe des Wassers der Regelfall. Durch den Einsatz von RMM können in diesen Fällen die Anlagen bis zu 5 Tage früher freigegeben werden. Dies ist nicht nur eine deutliche Zeitersparnis, sondern vereinfacht auch die Planung von solchen Arbeiten und Reinigungsschritten, da der Einfluss auf die Produktion auf ein Minimum reduziert werden kann.

    3. Schlussfolgerung

    Der Entwurf des GMP-Annex 1 von 2020 legt einen Schwerpunkt auf die CCS. Die Effektivität der Kontaminationskontrolle soll regelmäßig überprüft werden. RMM sollen für diesen Zweck in Erwägung gezogen und auf ihre Anwendbarkeit überprüft werden [5].

    Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen auf, dass der Einsatz von RMM neue Möglichkeiten der Überwachung und der Reevaluierung von Prozessabläufen, Betriebsweisen und Arbeitsvorgängen eröffnet. In Fällen, in denen früher 5 Tage auf mikrobiologische Ergebnisse gewartet werden musste, können nun RMM kurzfristig und ereignisnah reale Messwerte liefern. Durch die Detektion von VBNC bieten diese auch die Möglichkeit der Prozessverbesserung und der vorausschauenden Kontaminationskontrolle in Fällen, in denen die Arzneibuchmethode nur sehr wenige oder keine Zellen nachweisen konnte. Dadurch können nicht nur die Produktsicherheit erhöht werden, sondern auch der Betrieb (z. B. der Verwurf und die Sanitisierung von Erzeugeranlagen) optimiert werden.

    Literatur

    [1]M. E. J. Bartram, J. Cotruvo und A. G. C. Fricker, „Heterotrophic Plate Counts and Drinking-water Safety“, IWA Publishing, London, 2003.
    [2]European Pharmacopoeia Commission, „WATER FOR INJECTIONS“, in European Pharmacopoeia 10.0, 01/2017:0169.
    [3]European Pharmacopoeia Commission, „WATER PURIFIED“, in European Pharmacopoeia 10.0, 04/2018:0008.
    [4]A. Cundell, O. Gordon, N. Haycocks, J. Johnston, M. Luebke, N. Lewis, J. Mateffy und J. W. Weber, „Novel Concept for Online Water Bioburden Analysis: Key Considerations, Applications, and Business Benefits for Microbiological Risk Reduction“, American Pharmaceutical Review, 02.07.2013.
    [5]E. Commission, „Annex 1 draft“, 2020. [Online]. Available: https://ec.europa.eu/health/sites/default/files/files/gmp/2020_annex1ps_sterile_medicinal_products_en.pdf. Letzter Zugriff am 03.09.2021.
    [6]L. Jimenez, „Analysis of FDA Enforcement Reports (2012–2019) to Determine the Microbial Diversity in Contaminated Non-Sterile and Sterile Drugs“, American Pharmaceutical Review, 24.10.2019.
    [7]USP, „<1223> VALIDATION OF ALTERNATIVE MICROBIOLOGICAL METHODS“, USP43-NF38, 2020.
    [8]European Pharmacopoeia Commission, „5.1.6. ALTERNATIVE METHODS FOR CONTROL OF MICROBIOLOGICAL QUALITY“, in European Pharmacopoeia 10.0, 07/2017:50106.
    [9]M. J. Miller, E. R. van den Heuvel und D. Roesti, „The role of statistical analysis in validating rapid microbiological methods“, European Pharmaceutical Review, 2016.
    [10]L. Plourde-Owobi und F. Thiele, „A technological evaluation for "on-line" pharmaceutical water analysis.“, La Vague, Apr. 2021.
    [11]L. Grasso und F. Thiele, „Application of flow cytometry for microbiological monitoring of pharmaceutical grade water“, European Pharmaceutical Review, 2020.
    [12]N. Cohen, „Rapid Microbial Monitoring“, Pharmaceutical Engineering, Sept./Okt. 2018.
    [13]C. Fricker, „Detection of viable but non-culturable organisms“, Cleanroom Technology, 30.03.2016.
    [14]F. Thiele, „Einsatz der Durchflusszytometrie als Schnellmethode zur Überwachung der mikrobiologischen Qualität von Reinstwasser“, Pharm. Ind. 80, Nr. 11, 1542–1549 (2018).

    Key Words: Mikrobiologische Schnellmethoden, GMP-Annex 1, Kontaminationskontrollstrategie, WFI, Durchflusszytometrie

    Originaldokument