Dr. rer. nat. Sylvie Leech, 25. Oktober 2023

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Bei der Herstellung von Arzneimitteln unter aspetischen Bedingungen ist eine Depyrogenisierung des Primärpackmittels notwendig. Eine Versuchsreihe zeigt, dass die Behandlung mit trockener Hitze im Sterilisationstunnel hierfür geeignet zu sein scheint.

Bei der Abfüllung steriler Arzneimittel in die Primärverpackung wird in 2 Kategorien unterschieden:

• Pharmazeutika, die aus absolut reinen Bestandteilen unter aseptischen Bedingungen hergestellt werden müssen und
• Pharmazeutika, die im Endbehältnis sterilisiert werden können [1]. 

Erstere sind häufig Biopharmazeutika, die definitionsgemäß in Fermentations- bzw. Zellkulturprozessen gewonnen werden, oder deren Produktion solche Zwischenschritte inkludiert [2]. Der zu betreibende Aufwand und die Kritikalität der aseptischen Handhabung ist daher bei Biopharmazeutika und solchen Pharmazeutika, die aus anderen Gründen nicht terminal sterilisiert werden können, deutlich größer.

Pyrogene unterschiedlichen Ursprungs

Verunreinigungen können Mikroorganismen, Partikel oder Pyrogene sein. Wenn der Herstellungsprozess eines Biopharmazeutikums einen Zellkultur- und Fermentationsprozess-Schritt aufweist, ist es nahezu unmöglich, eine Verunreinigung mit Pyrogenen zu verhindern. Das Eindringen von Pyrogenen in die Blutbahn kann sehr starke, unerwünschte Immunreaktionen auslösen [3]. Nicht umsonst leitet sich der Begriff „Pyrogen“ vom Altgriechischen für „Feuer“ und „erzeugen“ ab [4].

Pyrogene können wie folgt unterschieden werden:

• „Biologisch aktiv“
  • bakterielle Pyrogene
    • Bestandteile gramnegativer Bakterien
    • Bestandteile grampositiver Bakterien
  • virale Pyrogene
  • Pyrogene als Bestandteile von Pilzen
• „tot“
  • Pyrogene nicht biologischen Ursprungs [4]

Zunächst muss die Konzentration der Pyrogene bestimmt werden. Hierfür gibt es unterschiedliche behördliche Vorgaben und Möglichkeiten.

Methoden zum Nachweis von Pyrogenen

Am häufigsten werden Endotoxine auch heute noch mit dem Limulus-Amöbozyten-Lysat(LAL)-Test nachgewiesen [5­7]. Allerdings gibt es Schwierigkeiten mit der Robustheit des LAL-Assays und der generellen Verfügbarkeit der Reagenzien. Besonders trickreich sind auch sog. Maskierungseffekte. Hierbei ändern Arzneimittelbestandteile die Struktur der Endotoxine und erschweren dadurch deren Nachweis [8].

Eine mögliche Alternative zum LAL bietet der rekombinante Faktor-C-Test [9]. Die offensichtlichste und größte Einschränkung der LAL- und Faktor-C-Tests ist, dass sie keinen Aufschluss über die vorhandenen Mengen weiterer Nicht-Endotoxin-Pyrogene (NEP) geben. Zu NEP zählen u. a. Peptidoglycane, Flagelline und Lipoteichonsäuren.

Eine weitere Alternative ist der Monozyten-Aktivierungstest (MAT) [10]. Dieser ermöglicht zum einen den Nachweis von NEP, zum anderen ist er ein regulatorisch konformer und robuster in vitro Assay. Beim MAT reagieren Monozyten mit Endotoxinen und NEP.

Depyrogenisierung des Primärpackmittels

Abbildung 1: Schematischer Ablauf eines Abfüllprozesses sowie vorbereitender Schritte (Quelle: [11], abgeändert).

Abbildung 1 zeigt einen möglichen Ablauf eines aseptischen Abfüllprozesses. Bei der Herstellung des Arzneimittels wird vor der Abfüllung mehrfach auf mikrobielle Verunreinigungen getestet (Abb. 1, rote Kreuze). Vor dem finalen Sterilisationsprozess wird in jedem Fall eine Probe genommen [11]. Der aseptische Abfüllprozess ist auf eine funktionierende Depyrogenisierung des Primärpackmittels „angewiesen“ (Abb. 1, Punkt B).

Depyrogenisierung mittels trockener Hitze

Die Sterilisation mit trockener Hitze ist ein Verfahren zur Depyrogenisierung, also zur Reduktion der Pyrogenkonzentration. Allerdings ist die Depyrogenisierung durch trockene Hitze kein einfaches Unterfangen, denn Endotoxine sind thermisch besonders robust [12].

Definitionsgemäß erwirkt ein erfolgreicher Depyrogenisierungsprozess eine Reduktion der Endotoxinkonzentration um mindestens 3 log₁₀-Stufen und liefert einen geeigneten F-Wert [13]. Der F-Wert ist ein weiteres Maß zur Qualifizierung eines Depyrogenisierungsprozesses. Er gibt die erforderliche Zeit an, die benötigt wird, um eine gleichwertige Zerstörung von Endotoxinen bei einer anderen Temperatur und innerhalb einer definierten Zeit zu erreichen [12].

Die Parameter des Depyrogenisierungsprozesses umfassen:

• Primärpackmittel
  • Material
  • Porosität des Materials
  • Abmessungen (Röhren- oder Hüttenglas)
• Temperatur
• Expositionszeit
• optional Kammerdruck (zur Aufrechterhaltung des Überdrucks)
• optional Luftgeschwindigkeit
• Luftqualität
• Wärmedurchdringung des Materials
• Wärmeverteilung/Gleichmäßigkeit
• Beschickungsmuster und Konfiguration, einschließlich Minimal- und Höchstlasten.

Diese Parameter verdeutlichen, dass es sich bei der Depyrogenisierung um einen komplexen Prozess handelt, dessen Einflussfaktoren gut kontrolliert werden müssen.

Trockene Hitze zersetzt Endotoxin-Moleküle physikalisch durch:

• Konvektion (Wärmeübertragung durch Bewegung von Flüssigkeit oder Luft),
• Wärmeleitung (Wärmeübertragung von benachbarten Molekülen) und
• Bestrahlung (Wärmeabgabe durch elektromagnetische Strahlung).

Forschungsdaten zur Depyrogenisierung mit trockener Hitze sind allerdings rar [12]. Die im Folgenden gezeigten Daten wurden von einem externen, wissenschaftlich exzellenten Partner erhoben: Sie zeigen die Effektivität von Depyrogenisierungsprozessen in Pharmaprozessanlagen.

Effektivität von Depyrogenisierungsmaßnahmen

In einem ersten Versuchsansatz wurde ein gängiges Primärpackmittel (ein röhrenförmiges Borosilikatglasvial) mit Endotoxin versetzt. Diesen Vorgang bezeichnet man als „Spiken“ (Abb. 2). Dazu wurde ein aufgereinigtes Lipopolysaccharid (LPS, Verbindung aus fettähnlichen Strukturen und Zuckerbestandteilen) aus Escherichia coli (E. coli) O113 verwendet. Dieses Endotoxin ist der primäre Standard beim bakteriellen Endotoxintest (BET). LPS ist Bestandteil der äußeren Membran gramnegativer Bakterien und wird bei deren Zerfall freigesetzt.

Abbildung 2: Versuchsablauf Präparation („Spiken“) des Primärpackmittels (Vial) mit Endotoxin (Quelle: Michael Kracklauer, Werner Iländer, Peter Alexander Kitschmann, Maike Piehler, Ruth Röder, Johannes Reich).

Um den Effekt unterschiedlicher Prozessschritte auf die Sterilität des Packmittels nachvollziehbar zu machen, wurden entsprechend der Angaben in Tab. 1 unterschiedliche Versuchsgruppen (c, d, e und Negativkontrolle) erstellt.

	Negativkontrolle*	c	d	e
Beschallen (1 min, 70 °C)			X
Waschen (80 °C)		X	X
Depyrogenisierung (15 min, 320 °C)		X	X	X

*Kein LPS
Tabelle 1: Unterschiedliche Behandlungsarten Primärpackmittel vorbereitend auf den aseptischen Füllprozess (*** Umgebungstemperatur) (Quelle: Michael Kracklauer, Werner Iländer, Peter Alexander Kitschmann, Maike Piehler, Ruth Röder, Johannes Reich).

Depyrogenisierung erzielt geforderte LPS-Reduktion

Innerhalb der Versuchsreihe war es wichtig nachzuweisen, dass die Endotoxinkonzentration nicht durch die verwendete Trocknungsmethode beeinflusst wurde (entsprechend Schritt 2, Abb. 2). Dies konnte ausgeschlossen werden. Zudem betrug die Wiederfindungsrate (Recovery) 100 %. Entsprechend kann angenommen werden, dass es innerhalb der Versuchsreihe zu keinen Maskierungseffekten (Low Endotoxin Recovery [LER]) kam.

Das Waschen mit anschließender Depyrogenisierung, das Beschallen und Waschen mit anschließender Depyrogenisierung sowie die Depyrogenisierung allein erwirkten eine Reduktion der LPS-Konzentration um 3 log₁₀ (Datenreihe c, d und e, Abb. 3). Die Behandlung im Depyrogenisierungstunnel ist also unbedingt notwendig, um die in den Regularien geforderte Reduktion um 3 log₁₀-Stufen zu erreichen [13].

Abbildung 3: Endotoxinkonzentration bei unterschiedlicher Behandlung des Primärpackmittels. Negativkontrolle = ohne Behandlung, c = Waschen, Depyrogenisieren. d = Beschallen, Waschen, Depyrogenisieren, e = Depyrogenisieren (n = 5) (Quelle: Michael Kracklauer, Werner Iländer, Peter Alexander Kitschmann, Maike Piehler, Ruth Röder, Johannes Reich).

Depyrogenisierung unterschiedlicher Packmittel

In weiteren Versuchen wurden unterschiedliche LPS-Arten (Reference Standard Endotoxin [RSE], Naturally Occuring Endotoxin [NOE]) und unterschiedliche Vials (Röhrenglas und Pressglas) verwendet (Abb. 4). Abbildung 4 zeigt, dass die behördlich geforderte Reduktion um 3 log₁₀-Stufen bei unterschiedlichen LPS-Arten und für unterschiedliche Packmittelarten erreicht wird.

Abbildung 4: Endotoxinkonzentration Röhrenglas und Endotoxinkonzentration Pressglas bei unterschiedlicher Vorbehandlung des Primärpackmittels und unter Verwendung verschiedener LPS-Arten (n = 5) (Quelle: Michael Kracklauer, Werner Iländer, Peter Alexander Kitschmann, Maike Piehler, Ruth Röder, Johannes Reich).

Waschen und Deyprogenisieren (c), Beschallen, Waschen und Depyrogenisieren (d) sowie Depyrogenisieren (e) konnten die behördlich geforderte 3 log₁₀-Reduktion erreichen. Die Reduktion konnte auch unter Verwendung verschiedener Endotoxinarten und auf unterschiedlichen Primärpackmitteln erwirkt werden.

Validierung des Depyrogenisierungsprozesses

Die Validierung eines Depyrogenisierungsprozesses mittels trockener Hitze hängt zum einen von der Tunnelladung ab, zum anderen von dem verwendeten Erwärmungszyklus. Bioindikatoren (BI) ­ einschließlich Positiv- und Negativkontrollen ­ für Hitzesterilisierungen sollen laut Richtlinie an „geeigneten“ Stellen angebracht werden, um die Sterilisation zu validieren. Bei der Verwendung von BI darf es zu keiner Kontamination des Prozessequipments mit mikrobiellem Material kommen. Zur Identifikation „geeigneter“ Stellen bedarf es außerdem einer guten Kenntnis des Prozessequipments und einer gewissen Erfahrung [15].

Bei der kontinuierlichen Hitzesterilisation/Depyrogenisierung im Tunnel sollten die Glasobjekte durch einen vertikalen, turbulenzarmen Luftstrom geführt werden. Dies schützt die Unversehrtheit und Leistung der Sterilisationszone Klasse A, sowie Druckverhältnisse innerhalb des Tunnels. Zudem ist die turbulenzarme, vertikale Luftströmung entscheidend für eine optimale Wärmeübertragung auf das Primärpackmittel und für die schonende Erwärmung des Objekts. Nach Möglichkeit sollte die Entwicklung unterschiedlicher Erwärmungszonen mittels Thermistor identifiziert werden. Hierfür wird häufig eine Schleppmessung durchgeführt. Auch unterschiedliche Beschickungsmuster spielen hier eine Rolle. Bei Erreichen der vorgegebenen Temperaturparameter bei definierter Zeit wird davon ausgegangen, dass die Depyrogenisierung erfolgreich war.

Computerbasierte Simulationen können unterstützend eingesetzt werden, um bereits vor der Prozessvalidierung an der eigentlichen Maschine Daten zu erheben. Solche Simulationen entsprechen auch den Vorgaben des überarbeiteten Annex 1 [13]. Computational Fluid Dynamics (CFD) ermöglichen z. B. eine volle Visualisierung der Luftströme aller Temperaturzonen des Depyrogenisierungstunnels.

Weitere Anforderungen umfassen:

• Mindestens ein Steril- bzw. Hochleistungsschwebstofffilter (HEPA-Filter) sollte die Luft im Tunnel filtern. Diese Filter am Heißlufttunnel müssen nach neuen Vorgaben mindestens 2-mal im Jahr einer Integritätsprüfung unterzogen werden [13].
• Jegliche Teile des Tunnels, die mit sterilisierten Komponenten in Kontakt kommen können, sind entsprechend zu desinfizieren und zu sterilisieren. Der Tunnel wird i. d. R. im Überdruck relativ zu sauberen Bereichen geringerer Qualität betrieben.

Energiebedarf der Depyrogenisierungstunnels

Um eine Reduktion der Endotoxinkonzentration um einen Faktor 1 000 zu erreichen, wird (z. B. bei Glaswaren in der kontinuierlichen Depyrogenisierung im Tunnel ) eine Temperatur von 250 °C über einen Zeitraum von 30 min gefordert [7]. Darüber hinaus gibt es andere Optionen für Temperatur und Expositionszeit, mit denen eine 3 log₁₀-Reduktion der Endotoxinkonzentration erreicht werden kann.

Im Vergleich zu anderen Maschinentypen einer klassischen Fülllinie für Glaswaren verbraucht ein Tunnel oft eine 9-fach oder höhere Energiemenge (Abb. 5). Daher ist eine innovative Mehrschichtisolierung zur Minimierung des Wärmeverlustes von großem Vorteil. Die Nutzung eines Umluftbetriebs kann zu einer weiteren Minimierung des Energiebedarfs beitragen. Hierdurch bedarf es dann auch keiner externen Luftzuführung zur Erhaltung der Druckkaskade in der Sterilisierzone. Durch diese Optimierung der Druckkaskaden werden wiederum Luftquerströmungen zwischen den Zonen minimiert.

Abbildung 5: Energieverbrauch am Beispiel einer Vial-Linie mit besonderem Augenmerk auf den größten Energieverbraucher, den Sterilisiertunnel (Quelle: Bausch+Ströbel).

Zusammenfassung

Wissenschaftlich fundierte Daten, zu welchem Grad eine Depyrogenisierung des Packmittels innerhalb der verschiedenen Prozessarbeitsschritte erfolgt, sind rar [12]. Oft wird eine 3 log₁₀-Reduktion der Endotoxinkonzentration auf dem Primärpackmittel zwar kommuniziert, wissenschaftlich fundierte Daten werden allerdings nicht erhoben. Die oben gezeigten Daten schaffen eine von kundenindividuellen Prozessen unabhängige Grundlage für die spätere Prozessvalidierung im pharmazeutischen Betrieb. Eine Reduktion der Endotoxinkonzentration um die rechtlich geforderten 3 log₁₀-Stufen konnte bei der Hitzesterilisation im DHT-Maschinentyp erreicht werden.

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Literatur

[1] Europäisches Arzneibuch (Ph. Eur.). 5.1.1 Methoden zur Herstellung steriler Zubereitung. 10. Ausg. Stuttgart: Deutscher Apotheker Verlag; 2020.
[2] Schüler J. Die Biotechnologie-Industrie: Ein Einführungs-, Übersichts- und Nachschlagewerk. 1. Aufl. Berlin, Heidelberg: Springer Spektrum; 2016.
[3] Rieth M. Endotoxine und Pyrogene: Nachweisverfahren, Produktprüfung, Inaktivierung. 1. Aufl. Weinheim: Wiley-VCH; 2021.
[4] Pyrogen. Wikipedia [Internet]. San Francisco: Wikimedia Foundation; 2023. Verfügbar unter https://de.wikipedia.org/wiki/Pyrogen
[5] United States Pharmacopeia (USP). <85> Bacterial Endotoxins. 18. Aufl. Rockville: The USP Convention; 2012.
[6] United States Pharmacopeia (USP). <1085> Guidelines on the Endotoxins Test. 18. Aufl. Rockville: The USP Convention; 2012.
[7] Europäisches Arzneibuch (Ph. Eur.). 2.6.14 Prüfung auf Bakterien-Endotoxine. 10. Ausg. Stuttgart: Deutscher Apotheker Verlag; 2020.
[8] Reich J, Lang P, Grallert H., Motschmann H. Masking of endotoxin in surfactant samples: Effects on Limulus-based detection systems. Biologicals. 2016 Sept; 44(5):417–422. Verfügbar unter: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27464990/
[9] Europäisches Arzneibuch (Ph. Eur.). 2.6.30 Prüfung auf Monozytenaktivierung. 10. Ausg. Stuttgart: Deutscher Apotheker Verlag; 2020.
[10] Solati S, ZhangT; Timman S. The monocyte activation test detects potentiated cytokine release resulting from the synergistic effect of endotoxin and non-endotoxin pyrogens. Innate immunity. 2022 Apr; 28(3-4):130–137. Verfügbar unter: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35491666/
[11] Krebsbach T (Hrgs.). Sterilherstellung in der pharmazeutischen Industrie: Aseptische Herstellung und terminale Sterilisation. Aulendorf: Editio Cantor Verlag; 2023.
[12] Sandle T. Endotoxin control in depyrogenation tunnels. Cleanroom Technology [Internet]. 2020 Feb. Verfügbar unter: https://www.cleanroomtechnology.com/news/article_page/Endotoxin_control_in_depyrogenation_tunnels/162489
[13] The Rules Governing Medicinal Products in the European Union Volume 4 EU Guidelines for Good Manufacturing Practice for Medicinal Products for Human and Veterinary Use. Annex 1: Manufacture of Sterile Medicinal Products. Brüssel: Europäische Kommission; 2022. Verfügbar unter: https://health.ec.europa.eu/system/files/2022-08/20220825_gmp-an1_en_0.pdf
[14] Guideline on sterilisation of the medicinal product, active substance, excipient and primary container. Amsterdam: Europäische Arzneimittel-Agentur (EMA); 2019. Verfügbar unter: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-sterilisation-medicinal-product-active-substance-excipient-primary-container_en.pdf
[15] Europäisches Arzneibuch (Ph. Eur.). 5.1.2 Bioindikatoren und verwandte mikrobiologische Zubereitungen zur Herstellung steriler Produkte.10. Ausg. Stuttgart: Deutscher Apotheker Verlag; 2020.

Weiterführende Literatur

Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. Rockville: U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration(FDA); 2012. Verfügbar unter: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/guidance-industry-pyrogen-and-endotoxins-testing-questions-and-answers

Die Links wurden zuletzt abgerufen am 25.10.2023.

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